黑木耳多糖对ICR小鼠皮肤光老化的保护作用

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[摘要]目的：探讨黑木耳多糖（Auricularia auricular polysaccharide,AAP）对icr小鼠皮肤光老化的保护作用。方法：选取健康雌性ICR小鼠共50只，随机分成5组各10只：正常组(A)、模型对照组(B)、模型+AAP低剂量（50 mg/kg.d）灌胃组(C)、模型+AAP中剂量（100 mg/kg.d）灌胃组(D)、模型+AAP高剂量（200 mg/kg.d）灌胃组(E)。长波紫外线（ultraviolet A, UVA）联合中波紫外线（ultraviolet B,UVB）照射小鼠制备皮肤光老化模型。每周一、三、五照射，第1周每次照射时间1h，以后每周依次增加1h，自第5周起为5h，直至第14周照光结束。每次照光前各治疗组小鼠给予不同浓度的AAP灌胃。实验结束后取小鼠背部皮肤用测试盒测定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)及谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-PX）活力、丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量；组织切片HE染色观察皮肤结构改变。结果：与正常组比较,模型对照组皮肤组织中SOD、GSH-PX活力显著降低（P

[关键词]光老化；黑木耳多糖；ICR小鼠

[中图分类号]R332 R758 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2012）05-0759-03

Protective effects of Auricularia auricular polysaccharide on skin photoaging in ICR mice

YI Qing-ling,ZENG Wei-hui,LIU Yan-ting,XU-lei

(Department of Dermatology of the Second Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University, Xi'an 710004，Shanxi,China;2.Department of Dermatology of The Second Hospital of Chengdu)

Abstract: Objective To study the protective effects of Auricularia auricular polysaccharide (AAP）on photoaged ICR mice skin. Methods Fifty healthy female ICR mice were divided into five groups (n = 10) randomly: normal group(A)，model control group(B),at dose of 50 mg/kg.d group(C), at dose of 100 mg/kg.d group(D), at dose of 200 mg/kg.d group(E). To establish skin photoaging mice models by irradiated UVA and UVB three times weekly (Monday,Wednesday and Friday).In the first week the time of UV exposure was 1 hour each time, then increased by 1 hour per week until week 5, and maintained the time until the 14th week. Before every UV irradiation, the AAP were orally administered with different dose to treated mice groups respectively. At the end of the experiment,the superoxide dismutase (SOD) and glutathione peroxidase (GSH-PX) activities, malondialdehyde (MDA) content in the skin were detected by assay kit.The skin tissue was observed by HE staining histological sections. Results Compared with the normal group, the activities of SOD and GSH-PX were decreased significantly (P

Key words：photoaging；Auricularia auricular polysaccharide; ICR mice

皮肤光老化是皮肤外源性老化的一个重要组成，是由自然光或人工紫外线（ultraviolet ,UV）光源反复照射引起的皮肤损伤[1]。日光中的长波紫外线（UVA）及中波紫外线（UVB）与光老化的发生密切相关。其发生机制之一是紫外线引起皮肤组织产生大量活性氧簇（reactive oxygen species，ROS），包括超氧阴离子自由基、羟自由基、过氧化氢和单线态氧[2]， 使机体发生氧化应激，造成细胞和组织的损伤。SOD、GSH-PX是机体重要的抗氧化酶，MDA是机体细胞膜受自由基攻击后产生的脂质过氧化产物，三者的测定相互配合能间接反映机体细胞受氧化损伤的程度。研究发现黑木耳多糖具有调节机体免疫力、抗肿瘤、抗衰老、降血脂、降血糖、抗凝血、抗突变、防辐射等生物活性[3]，有清除超氧阴离子、抗氧化及保护线粒体的功能[4]。本研究采用UVA联合UVB照射ICR小鼠建立光老化模型，探讨黑木耳多糖灌胃治疗对小鼠皮肤光老化是否具有保护作用。

1 材料和方法

1.1 材料：雌性断乳ICR小鼠,体重18～22g,由西安交通大学实验动物中心提供；40W紫外线灯管UVB4支、UVA2支，购于合肥赛帆试验设备有限公司； SOD、GSH-PX、MDA测试盒、考马斯亮兰蛋白测定试剂盒购于南京建成生物工程研究所；黑木耳多糖（纯度60%）购于西安斯诺特生物技术有限公司，常温干燥保存；可见光分光光度计、离心机、恒温水浴箱等。

1.2 造模:40W紫外灯管（UVB4支，UVA2支）并列装于木箱制成灯箱[5],将除正常组以外的各组小鼠分笼放入灯箱中照射，小鼠背部距灯源30cm。每次照射前灯管预热15分钟。首次照光前一天用电推剪和市售脱毛膏给小鼠背部脱毛,脱毛面积约9cm2，以后每周脱毛1～2次。每周照射3次（周一、三、五），第1周每次照射1h，以后每周每次增加1h，自第5周起每次5h，直至第14周照光结束。

1.3 动物分组及处理:ICR小鼠50只随机平均分成5组：正常组(A)、模型对照组(B)、模型+AAP低剂量（50mg/kg・d）灌胃组(C)、模型+AAP中剂量（100mg/kg.d）灌胃组(D)、模型+AAP高剂量（200mg/kg.d）灌胃组(E)。将黑木耳多糖溶解在生理盐水中配制成灌胃液。正常组及模型对照组灌胃相应体积的生理盐水。各组均在每次照光前称体重、灌胃。

1.4 取材：最后一次照光结束24h后用6%硫化钠溶液给小鼠背部脱毛。脱毛24h后腹腔注射水合氯醛处死小鼠，立即取下背部脱毛处全层皮肤。一部分放入10%福尔马林溶液中固定过夜，制作病理组织切片，HE染色。一部分皮肤去除皮下脂肪，在冰冻的生理盐水中漂洗，冷冻于-70℃冰箱以制备组织匀浆。

1.5 10%皮肤组织匀浆的制备：将皮肤用滤纸拭干，称重放入小烧杯中，加人冷生理盐水(生理盐水的总量是皮肤组织块重量的9倍)，尽快剪碎后移入玻璃匀浆器制成匀浆[6]用于测定GSH-PX、SOD活力及MDA含量。

1.6 指标测定：SOD活力的测定采用黄嘌呤氧化酶法；GSH-PX是一种重要的催化过氧化氢分解的酶，它特异的催化还原型谷胱甘肽（GSH）对过氧化氢的还原反应，其活力以催化GSH的反应速度来表示； MDA含量的测定采用硫代巴比妥酸法（TBA法）。各项指标的具体测定步骤按测试盒说明书。组织蛋白含量用考马斯亮兰蛋白测定试剂盒测定。每项指标的吸光度用可见分光光度计测定。

1.7 统计学处理：所有数据均用SPSS13.0统计分析软件处理，数据用 表示，各组均数间的差异用方差分析进行检验，并用LSD-t检验作两两比较。

2 实验结果

2.1 SOD、GSH-PX活力及MDA含量：与正常组比较,模型对照组皮肤组织中SOD、GSH-PX活力显著降低（P

2.2 肉眼观察：正常组小鼠背部皮肤光滑、薄嫩、红润、有弹性；随着照光剂量的增加模型对照组小鼠皮肤逐渐出现皮屑、褐黄、粗糙肥厚、深皱纹、缺乏弹性等光老化特征。AAP灌胃组皮肤外观接近正常组（图1）。

2.3 组织切片HE染色结果：利用图像分析系统(×20)观察，正常组表皮连续，结构完整、较薄、分层清晰，真皮层可见均匀分布的长条形胶原纤维束，方向与皮面平行（图2A）；模型对照组：表皮增厚，角化过度伴角化不全，真皮层明显变厚，纤维排列紊乱，分布不均，出现变粗、卷曲、断裂，说明光老化模型建立成功（图2B）。AAP治疗组表皮厚度接近正常，真皮纤维束排列较整齐均匀，少见断裂、卷曲等，较模型对照组有明显改善，尤其高剂量组更接近正常组表现（图2C～E）。

3 讨论

本课题通过UVA联合UVB照射ICR小鼠成功建立了小鼠皮肤光老化模型。结果显示长期紫外线照射使小鼠皮肤出现粗深皱纹、粗糙增厚、缺乏弹性、斑驳状色素沉着或颜色褐黄无光泽、皮屑或痂壳等典型光老化特征，组织切片上表现为真皮、表皮均明显增厚，表皮角化过度伴角化不全，真皮纤维变性，排列紊乱；皮肤组织中的抗氧化酶SOD、GSH-PX活力降低，脂质过氧化产物MDA含量升高。

大量研究证实，紫外线对皮肤的损伤与活性氧簇（ROS）的产生密切相关。ROS激活细胞表面相关受体，启动相关信号传导，导致基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）合成增多，同时抑制胶原蛋白的合成，MMPs可降解皮肤中的胶原纤维，引起皮肤光老化的典型组织病理改变[7]。人体的抗氧化防御系统包括：非酶抗氧化剂，如谷胱甘肽（glutathione, GSH）；酶抗氧化剂，如超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（catalase, CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)等[8]。ROS能消耗和破坏皮肤的非酶和酶抗氧化防御系统[9]，当产生的ROS超过了细胞的清除能力时，使机体发生氧化应激，造成细胞和组织的损伤。SOD能清除超氧阴离子自由基，保护细胞免受损伤。GSH-PX是一种重要的催化过氧化氢分解的酶，它特异的催化还原型谷胱甘肽（GSH）对过氧化氢的还原反应，可以起到保护细胞膜结构和功能完整的作用。MDA是机体细胞膜受自由基攻击后产生的脂质过氧化物，而且能进一步放大活性氧的作用，其含量的高低间接反应出细胞氧化损伤的程度。

已有研究发现黑木耳多糖（AAP）能升高自然老化小鼠模型血浆、心脏、肝脏中的SOD、GSH-PX活性，降低MDA含量[10]；能减少大鼠慢性脑缺血损伤，使脑组织中的SOD活性显著升高，MDA生成减少[11]；能提高高强度微波辐射大鼠血清中SOD活性，降低MDA含量[12]。李兴泰等人的研究发现AAP有清除超氧阴离子、抗氧化及保护线粒体的功能。本研究将AAP用于小鼠皮肤光老化的防治，结果提示黑木耳多糖能有效抵御紫外线对皮肤的老化损伤，减少皱纹、色素沉着等的发生，显著提高皮肤组织中SOD、GSH-PX活力，同时降低MDA含量。表明AAP对提高皮肤的抗氧化能力有积极的作用。其机制可能是一方面AAP本身具有清除自由基的作用；另一方面黑木耳多糖可以通过提高SOD、GSH-PX活力来达到增强抗氧化能力的目的。但具体机制尚待进一步的研究。

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[收稿日期]2011-12-13 [修回日期]2012-03-12