中华跌打酒的微生物限度检查法验证
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摘要 ：目的：建立中华跌打酒的微生物限度检查法验证。方法： 采用阳性试验菌，用三种方法测定回收率。结论： 细菌、霉菌和酵母菌的测定采用薄膜过滤法，控制菌检查用常规法。
关键词 ：中华跌打酒；微生物限度；检查法
中图分类号：U449.33
中华跌打酒具有消肿止痛 舒筋活血 止血生肌 活血祛瘀的功效 用于挫伤筋骨 新旧瘀患 风湿瘀痛等症。其中含有金不换、牛尾蕨、乌药、过江龙、地耳草、牛膝等中药成分，可口服也可外用。根据其中药成分及用药途径，按照2010年版《中国药典》应进行细菌、霉菌、酵母菌及控制菌的检查，并建立微生物限度检查方法，加以验证，以保证测定结果的可靠性。
1.试验仪器及试样
1.1仪器
电脑生化培养箱，脉动真空灭菌器，洁净工作台等
1.2 样品
中华跌打酒：批号：111104，111105，111106；生产厂家：广西梧州制药（集团）股份有限公司。
1.3实验菌种
金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003、大肠埃希菌CMCC（B）44102、枯草芽孢杆菌CMCC（B）63501、白色念珠菌CMCC（F）98001、黑曲霉CMCC（F）98003、铜绿假单胞菌CMCC（B）10104。均由中国药品生物制品检定所提供
1.4 培养基及稀释剂
营养琼脂培养基，玫瑰红钠琼脂培养基，营养肉汤培养基，胆盐乳糖培养基（BL），改良马丁培养基，改良马丁琼脂培养基，MUG培养基，PH7.0无菌氯化钠―蛋白胨缓冲液，0.9%无菌氯化钠溶液等。
2.细菌数、霉菌和酵母菌数测定方法的验证
2.1 菌液制备
2.1.1细菌检查的菌液制备：取新鲜的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的培养物至营养肉汤培养基中，培养18～24h，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液，做活菌计数备用。
2.1.2酵母菌检查的菌液制备：取新鲜的白色念珠菌的培养物至改良马丁培养基中，培养24～48h，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液，做活菌计数备用。
2.1.3霉菌检查的菌液制备：取新鲜的黑曲霉培养物接种至改良马丁琼脂斜面培养基，培养5～7d，加入3～5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将霉菌孢子洗脱。然后吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数为50～100cfu的菌悬液，做活菌计数备用。
2.2 供试液的制备方法
取本品原液作为供试液。
2.3 回收率测定
方法 试验组 菌液组 供试品对照组
常规法 取供试液1ml，并加入各菌液1ml注皿 取各菌液1 ml注皿 取供试液1 ml注皿 加金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌的平皿加入营养琼脂培养基，加白色念珠菌及黑曲霉的平皿加入玫瑰红钠琼脂培养基
培养基稀释法 取供试液1 ml，分别注入5个平皿中，每皿0.2 ml，各皿加入菌液1ml 取各菌液1 ml注皿 取供试液1 ml，分注5皿，每皿0.2ml
薄膜过滤法 取供试液1ml，加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，用缓冲液冲洗到最后一次加菌液1ml 取各菌液1 ml，加入100mlpH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液 取供试液1ml，加入100mlpH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液 加金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌的样品贴膜于营养琼脂培养基，加白色念珠菌和黑曲霉的样品贴膜于玫瑰红钠琼脂培养基
细菌置30～35℃培养2天，计数；霉菌及酵母菌置23～28℃培养3天，计数。同时作稀释剂和培养基的阴性对照。
2.4 回收率计算
试验组回收率（%）[（试验组平均菌落数一供试品对照组平均菌落数）÷菌液组平均菌落数]×100%
回收率 组别 金黄色
葡萄球菌 大肠
埃希菌 枯草芽孢杆菌 白色念珠菌 黑曲霉 供试品对照组菌落数 阴性对照
菌落数
常规法 111104 4.5% 36.2% 52.0% 32.9% 25.3% 无菌落生长 无菌落生长
111105 5.5% 36.8% 50.0% 35.2% 29.6% 无菌落生长 无菌落生长
111106 3.6% 37.2% 48.8% 33.8% 26.7% 无菌落生长 无菌落生长
培养基稀释法 111104 37.8% 64.7% 57.1% 60.0% 48.9% 无菌落生长 无菌落生长
111105 33.3% 62.3% 55.4% 61.7% 53.1% 无菌落生长 无菌落生长
111106 37.7% 67.7% 53.7% 68.4% 48.4% 无菌落生长 无菌落生长
薄膜过滤法 111104 101.4% 91.2% 98.8% 94.6% 96.0% 无菌落生长 无菌落生长
111105 98.5% 96.7% 101.3% 99.6% 93.0% 无菌落生长 无菌落生长
111106 101.2% 94.7% 100.0% 96.8% 98.5% 无菌落生长 无菌落生长
2.5结果：常规法及培养基稀释法中，金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌的回收率均低于70%，表明中华跌打酒对细菌、霉菌及酵母菌有抑制作用，不能采用常规法及培养基稀释法进行测定。薄膜过滤法中，大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌的回收率都高于70%，表明采用薄膜过滤法可以有效消除中华跌打酒抑菌作用的影响，采用薄膜过滤法进行细菌、霉菌和酵母菌计数是可行的。