海耳卵子显微结构观测
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精、卵同是遗传载体，但卵更是后续个体发育的基础，从这种意义上讲，对卵的超微结构进行研究更有价值。迄今为止，对海洋动物成熟卵超微结构的研究很多，而鲍科动物成熟卵的超微结构研究却很 少，仅 见 于 皱 纹 盘 鲍 （Haliotis discus han－nai）［1］及红鲍（H．rufescens）［2］，而耳鲍（H．asini－na）成熟卵的超微结构尚未见报道。耳鲍又称驴耳鲍，与九孔鲍（H．diversicolor aquatilis）、杂色鲍（H．diversicolor）、羊鲍（H．ovina）等同属暖水性鲍，分布于热带和亚热带海洋。在我国，主要分布于海南岛沿海，是海南省重要的鲍类养殖品种之一。2002年在海南的人工养殖初步试验表明，其人工养殖完全可行［3］。目前，正在开展海南耳鲍的人工育苗研究，成熟卵的形态结构与受精过程密切相关，是受精生物学的重要内容之一。研究耳鲍成熟卵的超微结构不仅对促进耳鲍的人工育苗进程有着十分重要的实际意义，同时还丰富了我国贝类受精生物学的基础理论。
1 材料与方法
1．1 材料
试验用耳鲍捕自海南岛沿海海域，选择性腺发育良好的雌鲍放入玻璃缸内，采用阴干、变温和紫外线照射刺激法诱导亲鲍排卵。
1．2 方法
1．2．1 光镜样品的制作
新排 放 的 卵 用0．1 mol／L磷 酸 缓 冲 液 （pH7．4）漂洗，用滴管轻轻来回吸取使沉积的卵均匀分散于漂洗液中，密度保持5个／mL，然后用滴管吸取单个卵子于显微镜下观察、拍照。
1．2．2 扫描电镜样品的制作
新排放的卵按常规扫描电镜样品处理方法，0．1mol／L磷酸缓冲液（pH 7．4）漂洗，TGL－16G型台式离心机中离心，4％戊二醛进行固定，丙酮各级梯度脱水，100％醋酸异戊酯置换，室温条件自然干燥，离子溅射法喷金导电处理，S－3000N型扫描电镜下观察、拍照。
1．2．3 透射电镜样品的制作
新排 放 的 卵 于TGL－16G型 台 式 离 心 机 中3000r／min离心10～30min，3％冷戊二醛固定10h，0．1mol／L磷酸缓冲液（pH 7．6）漂洗，用滴管轻轻反复吸取，使沉积的卵均匀分散在漂洗液中，然后加入蛋清，于离心机中离心（同上），将卵集中在蛋清中，使卵集中成一个整体，按常规方法，3％戊二醛固定，3％四氧化锇后固定，丙酮各级梯度脱水，Epon812包埋剂包埋，LKB－Nova超薄切片机进行切片，切片经醋酸双氧铀和柠檬酸铅染液双重染色，Joel－1010型透射电镜下观察、拍照。
2 结果
光镜下，耳鲍排出体外的成熟卵呈圆球形，淡绿色，直径约182μm，卵黄径约159．0μm。卵中心大而圆，约占卵体积的4／5，周围有二层透明的膜层结构（图1a）。扫描电镜下，卵表面光滑，具蜂窝状突起（图1b）。透射电镜下，耳鲍成熟卵由胶质膜、卵黄膜、细胞膜、细胞核和细胞质5个部分组成。
2．1 胶质膜
位于卵的最外层，厚约0．6～1．0μm，直接与外界接触。透射电镜下可见胶膜内有许多电子密度很低、分布较稀疏的纤维状细丝，胶膜与卵膜之间有明显分界（图1c、d）。
2．2 卵黄膜
位于胶质膜的内侧，紧贴于胶质层，也称卵膜，厚约0．5～0．7μm，电子密度中等（图1c、d）。
2．3 细胞膜
位于卵黄膜之下，也称质膜。质膜是一层极薄的单层膜，厚约0．15μm，形态清晰，较平滑，具明显单位膜特征。在细胞膜和卵黄膜之间有一空腔，称为卵周隙，不同部分卵周隙的厚度不一，约为0．2～0．5μm，电子密度明显淡于质膜和卵黄膜。卵周隙内具由质膜向卵周隙内突出的微绒毛。微绒毛有一层黏膜外衣，其基部位于质膜内，有的向内一直延伸至质膜下的细胞质中，有的则延伸至卵黄膜中。微绒毛扩大了卵母细胞与外界的接触面积。另外，卵周隙内还有许多空泡状结构（图1c、d）。
2．4 卵核
呈圆形或椭圆形，约占整个卵母细胞的2／3。在透射电镜下可见核内均匀分布着常染色质，核的边缘粗造，依稀可见核孔。
2．5 卵质
分布于卵核四周。卵质含有线粒体、高尔基复合体、内质网、卵黄颗粒和脂滴等细胞器。线粒体数量丰富，卵圆形或近似球形，嵴发达，分支管状，内充满电子密度较小的基质。线粒体较小，一般分布于卵黄颗粒及内质网的周围（图1e、f）。高尔基复合体由多个扁平膜囊构成，呈弓形排列，有的闭合成圆形，每一个扁囊由二层平行膜构成。在高尔基复合体扁囊膜的一面，可见一些体积较大的分泌泡；而在另一面，有许多微泡紧贴在扁囊膜上（图1e、f）。内质网有2种，滑面内质网形状不规则，粗面内质网多呈长条状，排列较为整齐，其外表面附有大量核糖体颗粒，附近经常有分泌颗粒分布，分泌颗粒圆形，电子密度较高，未见到膜相结构（图1f、h）。微吞噬小泡直径约0．36μm，未发现中心粒（图1g）。脂滴大而明显，数量较多，表面平整光滑，无膜相结构（图1e～g）。卵黄颗粒为卵圆形，中部电子密度致密，外周包围一层薄膜，随机分布于卵质中，大小不均，直径0．75～3μm（图1g、h）。另外，在耳鲍的卵质皮层中，还分布着一种细胞器—皮质小泡，亦称皮层颗粒，泡内为电子明区物质，呈空泡状，数量很少（图1i）。
3 讨 论
（1）卵周隙中的微绒毛是动物卵的一种固有结构。耳鲍的卵周隙内也见到了微绒毛，与已有研究的鲍类相比，微绒毛的数量大体相当，但与研究过的其他动物，如栉孔扇贝（Chlamys farreri）成熟卵相比，微绒毛的数量很少。
（2）根据卵黄在卵子中的含量和分布情况，一般可将各种动物的卵归纳为三大类：①均黄卵，卵黄量少且分布均匀，典型的如文昌鱼（Branchiosto－ma belcheri）和棘皮动物的卵。②中黄卵，卵黄集中在卵的中央，细胞质分布在卵黄的周围，如昆虫的卵。③端黄卵，卵黄集中在卵的一端，如大多数鱼类和两栖类的卵［4］。从卵子中卵黄的数量及分布情况看，耳鲍卵应划归为均黄卵，卵黄数量不多，随机分布在整个细胞细胞质中。另外，耳鲍成熟卵没有明显的卵极标志。
（3）鲍为原始腹足类，其卵子的发生和繁殖方式与双壳类相似，而与高等腹足类有很大差异。因此，卵质中的胞器更接近双壳类。皮质小泡是在卵子发生过程中由高尔基复合体形成的［4］。孙振兴等［1］研究皱纹盘鲍成熟卵时观察到2种形态的皮质小泡，一种小泡1．0～4．0μm，形状不规则，泡内含有中等电子密度的絮状或微细颗粒物质，另一种小泡1．5～5．0μm，形状不规则，泡内为电子明区物质，呈空泡状。笔者只观察到了一种皮质小泡，泡内为电子明区物质，呈空泡状，与孙振兴等［1］观察到的第2种小泡非常相似，但与任素莲等［5］在栉孔扇贝成熟卵中观察到的皮质小泡（小泡内一端为均匀高电子密度物质，另一端为疏松均匀的低电子密度）相比，存在着形态和类型上的差异。