核转染仪辅助转染肝素酶基因siRNA有效性的实验研究
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摘 要 目的 研究核转染仪转染肝素酶基因siRNA的有效性。方法 采用核转染仪辅助转染技术和常规脂质体转染技术转染针对肝素酶基因启动子区和编码区设计sirna，并通过实时定量RT-PCR，Western blot等技术检测2种转染技术转染后，肝癌细胞SMCC-7721在48h、72h和96h时肝素酶基因表达情况。结果 2种转染技术在转染后48h，从mRNA和蛋白水平上均能成功干扰掉肝素酶基因；但在转染后72h，脂质体转染组基因很快恢复表达，而核转染仪转染组基因仍保持沉默；在96h后，2组的肝素酶基因均恢复表达。结论 核转染仪可有效转染肝素酶基因siRNA，并使肝癌细胞SMCC-7721的肝素酶基因表达下调，且维持较长时间。
关键词 核转染仪 肝素酶基因 肝癌细胞
RNA干扰（RNA interferance，RNAi）是近些年在分子生物学中迅速发展起来的一项新技术，是基因功能研究最常用手段之一[1]；它包括转录水平（Transcriptional gene silencing ，TGS）和转录后水平（post-transcriptional gene silencing， PTGS）2种基因沉默方式[2]。通常所说的RNAi指的是PTGS，通过基因编码区设计的小分子RNA（siRNA）能与对应的mRNA靶序列特异结合，并使靶序列降解，从而使基因沉默[1]。由于基因上游转录水平持续活跃，不停地产生大量mRNA，要使基因持久沉默，就得不停地给予外源性siRNA。因此，PTGS的干扰效率不高。研究发现植物细胞存在高效率的TGS现象，即在DNA水平上通过基因5’端启动子区域DNA甲基化或组蛋白去乙酰化形式使基因永久沉默；这种现象被称为siRNA指导下的DNA甲基化（siRNA-direct DNA methylation）或组蛋白修饰[3，4]。2004年Kawasaki 等[5]首次发现在人细胞也存在TGS现象。理论上讲，一次给予针对基因5’端启动子的siRNA，就可使该基因由于表观遗传修饰而保持持久沉默[6～8]。因此，TGS相对于PTGS的研究更具有经济性和临床应用前景[9]。肝素酶基因（heparanase gene，HPA）位于人染色体4q 21.3，其5’端启动子区域含有CpG岛，表明基因的表达受甲基化等表观遗传学机制调控[10]；HPA在肝癌、乳腺癌、大肠癌、肺癌和淋巴瘤等多种肿瘤中都有高水平的表达[11～13]，主要参与肿瘤转移和侵袭。然而，TGS的沉默对象是位于细胞核中的非编码DNA调控序列，siRNA必须进入细胞核内才能发挥作用。近年由于核转染技术发展，尤其是德国AMAXA公司研发的NucleofectorTM专利创新技术，它采用电穿孔技术与细胞类型特异的核转染溶液结合方法，直接将DNA序列转入细胞核内，即使是常规转染无法转染的原代培养细胞和不分裂细胞也可成功转染，其转染率可高达70%以上，速度快，转染2h后就能发挥作用，操作简单方便[14，15]。但目前尚未见该技术用于TGS研究，既往TGS研究采用常规脂质体转染技术。本研究采用HPA基因为模型，比较核转染仪辅助转染技术和常规脂质体转染技术在肝素酶基因沉默效果和沉默维持时间上的差别。
1 材料与方法
1.1 材料
DMEM培养基、胎牛血清、含100 U/mL青霉素、100 U/InL链霉素的青链霉素混合液均购自Gibco公司，SMMC-7721细胞（中科院上海细胞所），NucleofectorTM电转试剂盒（德国Amaxa公司），德国Amaxa公司单孔核电转仪，型号2b（北京达科维生物公司提供），Trizol试剂（invitrogen公司），逆转录试剂盒（fermentas公司），2×Taqmix（ABI公司），兔抗人肝素酶多克隆抗体、HPR标记羊抗兔抗体（Santa公司），PVDF膜（ Santa 公司），发光试剂盒，Transwell小室（BD公司）；Lipofetmiane 2000试剂盒（美国Invitrogen）。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 从液氮中取出SMMC-7721细胞，42℃热水迅速复苏，用高糖DMEM加10%的血清和1%的青链霉素混合液，放入37℃、5%CO2、常规湿度培养箱中培养。
1.2.2 干扰片段设计 针对肝素酶基因启动子区，分别设计多个干扰片段（siRNA），在预实验中筛选出干扰效果较理想的siRNA；TGS的 siRNA为：GAGGAAGUGCUAGAGACUCU；同时对HPA基因编码区设计RNAi片段：CCUUAAGAAGGCUGAUAUU（图1），整个设计合成由美国BIOO公司协助完成，设计完成后的siRNA经过DNAMAN软件与原基因组BLAST以后，与肝素酶基因的启动区完全匹配。
1.2.3 基因转染 实验分为3个组，核转染仪组，脂质体转染组及对照组（不含siRNA）。在转染前1 天，将对数生长期的SMMC-7721细胞按l×106个铺于10cm培养皿中，细胞生长至90%融合时进行转染，方法按照Amaxa电转染试剂盒产品说明书进行，即选择多个参数进行预实验，优化好转染参数，将培养在对数生长期的106个肝癌细胞与siRNA混合，加入转染液，重悬细胞，放入转染杯，在电转染仪中进行转染，将转染后的细胞放入37℃，5%CO2培养箱中继续培养。脂质体常规转染采用Lipofetmiane 2000试剂盒，具体操作按说明书进行。
1.2.4 RT-PCR 分别收集转染后48h、72h和96h的细胞，trziol一步法分别提取细胞总RNA，用逆转录试剂盒将其逆转为cDNA后，PCR检测各组细胞肝素酶基因表达情况。HPA基因上游引物：ATGTGGAGGAGAAGTTACGG，下游引物：TGAGTTGGACAGATTTGGAA；PCR条件为94℃/ 3min； 94℃ /30s；55℃/ 30s；72℃ /45s，共32个循环，最后72℃ 延伸10min。
图1 HPA基因启动子siRNA设计示意图
1.2.5 实时半定量RT-PCR HPA基因上游引物：GTGGTGATGAGGCAAGTATTC，下游引物：GTGGTGATGAGGCAAGTATTC。采用EverGreen I PCR试剂盒（Biotech）进行实时荧光半定量PCR反应，操作按说明进行，一管中不加模板用作阴性对照。反应液混匀后，置于SLAN荧光定量PCR仪中。设立程序：95℃ /5min预变性后，94℃/30s， 60℃退火45s，72℃延伸45s， 循环40次，最后72℃充分延伸10min。PCR反应结束后从55℃到95℃按每级0.5℃递增作出溶解曲线，分析每个PCR反应的溶解曲线以确保PCR扩增产物的特异性。每个反应重复3次。内参β-actin作一相对标准曲线，根据内参和目的基因的Ct值计算该基因相对表达量。
1.2.6 Western blot检测 将转染后48h，72h和96h的细胞裂解，收集蛋白质，Bradford法测定含量。蛋白变性后每孔上样70μg，经10%SDS一聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白后转移至PVDF膜上，用含5%脱脂牛奶封闭1h。用5%脱脂牛奶稀释一抗（β-actin以1：2000稀释，兔抗肝素酶抗体以1：500比例稀释）4℃摇床孵育过夜，PBST洗膜3×10 min，加入相应的二抗（PBST1：1000稀释）室温温育1 h，PBST洗膜3×10 min，化学发光试剂检测蛋白质印迹，X线暗室曝光成像。
2 结果
2.1 实时半定量RT-PCR定量检测核转染仪和脂质体转染技术对基因沉默效果
定量检测结果示：在转染48h后，2种方法对HPA基因mRNA表达几乎达到100%的抑制；72h后，脂质体转染组HPA基因表达有所恢复，而核转染组仍保持100%的抑制；在转染96h后，2组HPA基因均恢复表达，表达相对量接近对照组的一半。（图2）
2.2 Western杂交检测核转染组和脂质体转染组对HPA基因沉默效果
western 杂交结果显示，转染后48h，2组干扰细胞的HPA基因蛋白表达完全沉默；72h后，脂质体组HPA基因蛋白再次表达，而核转染组HPA仍保持沉默；96h后，2组细胞的HPA蛋白恢复表达（图3）。
图2 实时定量RT-PCR检测核转染组和脂质体转染组转染48h、72h、96h后HPA表达情况
图3 western blot 检测核转染组和脂质体转染组分别在转染后48h、72h、96h后，HPA表达情况
3 讨论
恶性肿瘤细胞的浸润、转移一直是肿瘤临床治疗关键和难点，而肝素酶基因被证明在肿瘤的侵润转移中起着重要作用[12]。随着肿瘤发展分子机制阐明，肿瘤的基因治疗成为目前研究重点之一；近年用RNAi技术在多种不同肿瘤细胞中成功干扰多种靶基因表达，抑制肿瘤细胞生长，已成为目前肿瘤治疗研究热点[1]。这些基因除肿瘤基因，还包括抗凋亡分子、端粒酶、生长因子受体、某些信号分子等基因。应用RNAi 技术，还可探索各种基因功能及相互作用，为筛选新的药物靶基因提供便利。已有实验证明，通过RNAi沉默肝素酶基因，可以阻止部分肿瘤的侵袭和转移[16]。
传统的靶向肿瘤基因RNAi治疗是建立在转录后水平上，其缺点是：基因的启动子活跃，靶基因能被持续转录，要想使基因长期沉默，需要不间断地给予siRNA。而目前由于用于人类肿瘤基因治疗载体存在许多问题，建立长期稳定的特异性在瘤细胞内表达的治疗基因载体并用于临床治疗尚不成熟。用于临床上实验性治疗药物多为体外合成并经化学修饰的寡核苷酸，不仅价格昂贵，半衰期短，且有一定细胞毒性；要使靶基因沉默，需长期给药，不仅疗效受到影响，毒性很大，也不经济。而转录水平的RNAi不仅诱导基因调控序列同源靶序列被降解，还可以诱导异染色质形成，DNA甲基化，组蛋白修饰等表观遗传学改变，使基因不能转录；理论上讲，一次给予针对5’端启动子的siRNA就可使该基因永久沉默，因此对于转录水平的RNA干扰，有着更广泛地应用前景[9]。要实现TGS， 必须要将siRNA有效转入细胞核内，本项研究是通过核转染仪将设计在肝素酶5’端的siRNA转入肝癌细胞，以证实转录水平干扰的优越性。
研究首先针对细胞核内的启动子区，设计siRNA靶点，同时对胞浆内的mRNA区设计相应siRNA靶点，通过PCR初步检测发现，2组细胞在干扰发生48h后，基因同时都被沉默；72h时，脂质体转染组细胞基因沉默效果明显下降，而核转染组细胞基因沉默效果仍然很明显，96h时，2组细胞的肝素酶基因再次同时表达出来，RT-PCR证实这个结果。从Western blot实验也进一步证明，核转染技术的转录水平沉默肝素酶基因比脂质体的转录水平沉默肝素酶基因细胞，肝素酶的沉默时间维持更长些；但是96h的时候，2组肝素酶蛋白又再次表达。相对于脂质体的转录后基因沉默，核转染转录水平的基因沉默维持时间相对更持久，但并未达到先前预期的基因永久沉默目的。
尽管本次实验从基因水平和蛋白水平都无法证实，TGS对基因有着永久沉默作用；但是相比于PTGS，TGS对基因沉默维持时间显然有所延长。上述结果与理论上转录水平干扰能持久沉默基因的推测仍然有较大差距，其原因可能有：（1）细胞核转染的效率；电转染只有一少部分siRNA被转染进核中，多数siRNA还是留在胞浆内被降解，可能会造成实验结果不理想。在实验中，用普通的脂质体转染HPA调控区siRNA，TGS几乎无任何基因沉默作用，而转染编码区siRNA， PTGS却有明显基因沉默效应（结果未公布），说明TGS必须用有效的核转染技术。（2）不同细胞或基因对TGS的效果不同。可能不同细胞或基因表达调控受多种机制影响，表观遗传学因素只是其中一种。（3）表观遗传学控制基因的表达是可逆的。
虽然如此，本实验为TGS在肿瘤基因治疗中的研究提供实验基础，至于TGS的作用机制，以及是否针对CpG岛或转录因子结合位点的RNAi更有效，一次RNAi导致的表遗传学改变能维持多长时间（细胞能传多少代），是否含有CpG岛的基因更适合针对启动子的RNAi等等，则需要更多实验加以论证。
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