砒霜对MRL/lpr自发性狼疮小鼠外周血单个核细胞DNMT1及CD11a表达的影响
开篇：润墨网以专业的文秘视角，为您筛选了一篇砒霜对MRL/lpr自发性狼疮小鼠外周血单个核细胞DNMT1及CD11a表达的影响范文，如需获取更多写作素材，在线客服老师一对一协助。欢迎您的阅读与分享！
摘 要：目的：探讨砒霜(三氧化二砷 ATO)对mrl/lpr自发性狼疮小鼠外周血单个核细胞（PBMC）中DNA甲基转移酶1（dnmt1）和黏附分子淋巴细胞功能相关抗原-1（LFA-1）的亚基cd11a表达的影响及其可能作用机制。方法：20周龄（发病期）MRL/lpr狼疮小鼠24只，设C57BL正常小鼠24只做参照，随机平分两组，即治疗组(ATO组)和对照组(NS组)，治疗组ATO 0.4mg·kg-1·d-1隔日腹腔注射，对照组隔日腹腔注射同等量生理盐水，疗程为60天，采用RT-PCR检测两组小鼠PBMC的DNMT1及CD11a转录水平的表达情况。结果：MRL/lpr小鼠治疗组中DNMT1-mRNA的灰度比值对照组增高（P＜0.05），MRL/lpr小鼠治疗组中CD11a-mRNA的灰度比值较对照组降低（P＜0.05）。结论：砒霜能逆转系统性红斑狼疮(SLE)的低甲基化状态。
关键词：砒霜；系统性红斑狼疮；DNA甲基转移酶1；CD11a
中图分类号：R593.24文献标识码：A文章编号：1673-7717(2011)12-2750-03
Effects of Arsenic Trioxide on the Expression of DNA Methyltransferase 1 and CD11a
Genes in Peripheral Blood Mononuclear Cells of Lupus Nephritis-prone MRL/lpr Mice
WANG Hong1，XIE Qipeng2
(1.Department of Nephrology,Rheumatology Immunology，Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College，Wenzhou 325000，
Zhejiang,China;2.Climical Lab,Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College,Wenzhou 325000,Zhejiang,China
Abstract:Objective：To investigate the ATO regulatory mechanism on the expression of DNA Methyltransferase 1-mRNA and CD11a-mRNA in lupus nephritis-prone MRL/lpr mice. Methods：24 MRL/lpr mice （20 weeks old ）and 24 C57BL mice were equally divided into 2 groups randomly: control group (saline ,NS group) and treatment group (arsenic trioxide 0.4 mg/kg·d, ATO group) . These drugs were given by abdominal injection for 60 days.The expression of DNMT1 and CD11a was determined by RT-PCR. Results： The gray scale value of DNMT1 - mRNA in ATO group was significantly higher than that in NS group（P＜0.05）in MRL/lpr mice ,and the gray scale value of CD11a-mRNA in ATO group was significantly lower than that in NS group （P＜0.05）in MRL/lpr mice .Conclusion：The mechanism of ATO of the treatment of SLE may be related with reversed low methylation.
Key words:Arsenic Trioxide Systemic Lupus;Erythematosus;DNMT1;CD11a
________________________________________
收稿日期：2011-07-05
基金项目：温州市科技计划项目 (Y20100158)
作者简介：王红（1978-），女，浙江绍兴人，主治医师，硕士研究生，研究方向：风湿免疫。系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)发病机制仍不明确。近年来有研究发现SLE患者中存在基因组DNA的低甲基化，且其甲基化降低的水平与病情的严重程度呈正相关\[1\]。砒霜，其有效成分为三氧化二砷(ATO)，近年来国内外有学者提出ATO可能是SLE治疗领域中一种很有前景的新疗法\[2-5\]，但其作用机制尚未完全清楚。笔者前期的体外实验通过与5-氮胞苷作对照，证实ATO可影响MRL/lpr自发性狼疮小鼠脾脏单个核细胞的甲基化状态\[6\]。本实验通过体内试验检测ATO对MRL/lpr小鼠(SLE的常用动物模型)外周血单个核细胞(PBMC)中DNA甲基转移酶1（DNMT1）及黏附分子LFA-1的亚基CD11a表达水平的影响，以探讨其在体内是否也能逆转MRL/Ipr狼疮小鼠的低甲基化状态来治疗SLE。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 MRL/lpr自发性狼疮小鼠购自中国科学院上海实验动物中心，雌雄各半，至20周龄（发病期），体重30～40g，随机分为治疗组（ATO 组）和对照组（生理盐水NS组），每组12只。C57BL小鼠由温州医学院动物实验中心提供，体重18～20g，随机分为ATO 组和NS组，每组12只。饲养在温州医学院动物实验中心清洁级动物房中。ATO 组给予ATO 0.4mg·kg-1·d-1溶于生理盐水，隔日腹腔注射，对照组给予等量生理盐水同时隔日腹腔注射，治疗至60天结束。
1.1.2 主要药物和试剂 ATO购自美国Sigma公司；枸橼酸钠购自北京中杉金桥生物技术公司，与蒸馏水配成38%的浓度；Ficoll淋巴细胞分离液购自上海基新生物科技有限责任公司；焦碳酸二乙脂购自上海生工生物公司；Trizol Reagent购自美国Invitrogen公司；RT-PCR反应体系购自大连宝生物工程有限公司；琼脂糖(Agarose)购自美国Promega公司；载样缓冲液购自美国Promega公司；DNA marker DL-2000购自大连宝生物工程有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 外周血单个核细胞PBMC的采取和分离 分别取MRL/lpr狼疮小鼠和C57BL正常小鼠24只，脱颈椎处死，摘除眼球取其外周血，Ficoll淋巴细胞分离液分离PBMC，计数1×106/mL个细胞；-80℃保存备用。
1.2.2 RNA的提取 采用Trizol Reagent自PBMC中提取总RNA，用岛津紫外分光光度计法测定RNA浓度及纯度。
1.2.3 c-DNA的逆转录合成 根据RT-PCR试剂盒说明书进行逆转录反应。
1.2.4 引物的合成 所有引物均为Primer 5.0设计并由上海生工生物技术公司合成。DNMT1引物序列为：上游5’- CACCATCACGGCTCACTTC-3’，下游5’-GGCCCGCTGTTACCTCTTC-3’，产物长度为182 bp；CD11a引物序列为：上游5’- TCTGCCTATGACCACAACA-3’，下游5’-TCTCCCACCTGAAGACAAT-3’，产物长度为211 bp；GAPDH引物序列为：上游5’-CACCATCTTCCAGGAGC GAG-3’，下游5’-GCAGGTTTCTCCAGGCGG-3’，产物长度为537 bp。
1.2.5 半定量PCR反应条件 PCR 反应体系总体积为25μL，将反应物于94℃预变性5min后，于94℃变性30s，其中DNMT1产物于55℃退火；CD11a产物于58℃退火；GAPDH产物于55℃退火，72℃延伸45s，进行35次循环（其中GAPDH产物进行30次循环），最后于72℃延伸10min。
1.2.6 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳、凝胶成像和凝胶图像分析 反应产物行1.5%琼脂糖凝胶电泳, 显色条带经图像分析系统检测其灰度值，与管家基因GAPDH 扩增带G 之比值即表示DNMT1、CD11a mRNA表达水平参数。
1.3 统计学处理
采用SPSS 12.0统计软件。计量资料以±s表示，组间比较采用t检验。
2 结 果
两组MRL/lpr和C57BL小鼠SMC中DNMT1、CD11a- mRNA表达水平的比较，见表1及图1～2。
注：与NS组比较，*P＜0.05。泳道1、2为MRL/lpr小鼠的NS组、ATO组；3、4为C57BL小鼠的NS组、ATO组
图1 MRL/lpr和C57BL小鼠PBMC中DNMT1-mRNA
的表达水平（灰度比值）
由表1及图1～2可见，MRL/lpr小鼠ATO组中DNMT1- mRNA的灰度比值较NS组增高；MRL/lpr小鼠NS组和ATO组中DNMT1- mRNA的灰度比值均较C57BL小鼠降低。MRL/lpr小鼠ATO组中CD11a-mRNA的灰度比值较NS组降低；MRL/lpr小鼠NS组和ATO组中CD11a-mRNA的灰度比值均较C57BL小鼠增高。
泳道1、2为MRL/lpr小鼠的NS组、ATO组；3、4为C57BL小鼠的NS组、ATO组
图2 MRL/lpr和C57BL小鼠PBMC中CD11a-mRNA
的表达水平（灰度比值）
3 讨 论
MRL/ lpr小鼠具有多种与人类系统性红斑狼疮（SLE）相似的病理生理学特征，因而常用于研究人类SLE。SLE是一多系统的自身免疫性疾病，由于其发病机理至今未明，故治疗上也很棘手。尽管使用了激素及免疫抑制剂，但其预后仍不乐观\[7\]。传统中药同西药相比具有使用安全，不良反应小，价格低廉及综合调理等优点\[8\]，故本研究尝试将中药砒霜用于治疗SLE，为传统中药的应用提供新的开发前景。
众所周知，砒霜属于剧毒物质，其有效成分为三氧化二砷。自从1992年国内率先采用砒霜（三氧化二砷 As2O3)治疗急性早幼粒细胞白血病(APL)获得成功以来\[9\]，国内外相继开展了多个临床疗效观察研究，认为该药物临床疗效良好，且毒性较低。Bode等\[2\]提出ATO可能是SLE治疗领域中一种很有前景的新疗法，伍洲炜等\[10\]研究发现在活动性SLE患者存在DNA低甲基化，其DNMT活性为正常人的1/3到1/2，且与疾病的严重程度呈正相关；有研究报道SLE患者DNA的低甲基化状态可导致黏附分子LFA-1过度表达\[11\]，且活动期LFA-1的亚基CD11a表达水平较静止期增高\[12\]，可作为判断其活动的重要指标之一。根据上述研究结果，笔者认为DNMT基因的低水平表达和LFA-1基因的过高水平表达可能是SLE发病机制中重要的内源性因素之一。
目前我国关于ATO治疗SLE的研究刚起步，笔者前期的体外实验通过与5-氮胞苷作对照，证实ATO可改善MRL/lpr自发性狼疮小鼠脾脏单个核细胞的低甲基化状态\[6\]。本实验通过体内试验检测ATO对MRL/lpr小鼠外周血单个核细胞(PBMC)中DNA甲基转移酶1（DNMT1）及黏附分子LFA-1的亚基CD11a表达水平的影响。结果显示：ATO可升高MRL/lpr小鼠PBMC中DNMT1基因表达水平，降低CD11a 基因表达，但对C57BL小鼠的表达水平则无明显影响；实验结果亦提示，ATO可使DNA的低甲基化程度改善，抑制CD11a的过度表达，从而达到治疗SLE的目的。因此笔者认为，本研究中ATO的剂量可能通过逆转SLE的低甲基化状态从而发挥SLE的治疗作用。
本研究只检测了ATO对DNMT1及CD11a表达水平的影响，未检测其抗体水平及补体水平，亦未设置CTX组作为治疗组来比较ATO的疗效，有待于更进一步的研究。
参考文献
\[1\] Lu Q,Kaplan M,Ray D,Ray D,et al.Demethylation of ITGAL (CD11a) regulatory sequences in systemic lupus erythematosus\[J\].Arthritis Rheum,2002,46(5):1282-1291.
\[2\] Bode P，Bonardelle D，Benihoud K，et al.Arsenic trioxide：a promising novel therapeutic agent for lymphoproliferative and autoimmune syndromes in MRL/Iprmice\[J\].Blood，2006，108：3967-3975.
\[3\] 夏晓茹，林素仙，周艳，等.三氧化二砷对BXSB狼疮小鼠自身免疫及其生存时间的影响\[J\].中国中西医结合杂志，2007，27：138-141.
\[4\] 朱小春，吕呤秋，黄朝兴，等.亚砷酸对BXSB狼疮鼠狼疮性肾炎的治疗作用\[J\].中国中西医结合肾病杂志，2004，5：7-10.
\[5\] 王晓冰，章圣辉，邹贤斐，等.三氧化二砷对MRL/Ipr狼疮鼠抗ds-DNA抗体和脾淋巴细胞亚群增殖的影响\[J\].基础医学与临床，2008，28：446-449.
\[6\] 王红，孙莉，陈培荣，等.三氧化二砷对MRL/lpr自发性狼疮小鼠脾脏单个核细胞DNMT1及CD11a表达的影响\[J\]. 浙江医学，2008，30（11）：1191-1192，1236.
\[7\] Cameron JS. Lupus nephritis: an historicalpe respective1968-1998［J］. J Nephrol 1999,12 (suppl 2):S29-S41.
\[8\] 金买.系统性红斑狠疮的中医药研究现状及其评价［J］.江苏中医，1999,20(12):3-5.
\[9\] 孙鸿德，李元善，马玲，等.癌灵1号治疗APL32例疗效观察［J］.中国中西医结合杂志,1992，12:170.
\[10\] 伍洲炜，施伟民. DNA 低甲基化在SLE发病中的作用\[J\]. 同济大学学报（医学版），2006，27（增刊）：20 - 22.
\[11\] 丁艳，肖嵘，李亚萍，等.T细胞DNA低甲基化在SLE的研究进展\[J\].国外医学·皮肤性病学分册，2005，31：232-234.
\[12\] 梁虹，张璃，徐世正.系统性红斑狼疮患者外周血细胞黏附分子CD11a、CD11b、CD11c、CD54的表达\[J\].中华皮肤科杂志，2006，39：356.
________________________________________
《中医药通报》2012年征订、征稿启事
《中医药通报》是中华中医药学会主办的系列杂志之一，为国内外公开发行的综合性中医药学术期刊。本刊的办刊方针和任务是：全面报道我国中医、中西医结合、中药研究在临床、预防、科研、教学等方面的最新进展、成果和诊疗经验，探讨中医药学术提高的思路和方法，介绍国内外中医药研究动态，开展学术争鸣，反映中医药市场现状与开拓前景，临床治疗新方法及新药研究开发成果。
《中医药通报》是国内唯一的通报类中医杂志。2007年获国家中医药管理局颁发的全国中医药优秀期刊奖。
本刊设有院士及专家论坛、进展述评、研究快报、获奖成果介绍、专题笔谈、基础研究、临床论著、临床报道、诊法研究、理法研究、针灸经络、中药研究、方剂研究、（中药）新药介绍与评价、药物不良反应、实验研究、医史研究、名医精华、名医研究、学术动态、综述、思路与方法、诊余心悟、茧斋夜话、医案医话、病例讨论、护理研究等栏目。
欢迎国内外专家、作者踊跃投稿，惠赐佳作。
稿件要求一式二份，请注明联系电话、传真、E-mail。稿件请寄本刊编辑部。
本刊为双月刊，大16开本，每期66页，逢双月25日出版。国内刊号CN35-1250/R，国际刊号ISSN1671-2749。国内定价每期10.00元，全年定价60.00元。国外全年定价60.00美元（上述定价均含邮资）。
期刊邮发代号 34-95
订 阅 全国各地邮政局（所）
欢迎新老订户订阅。如读者在当地邮局订阅不便或漏订，本刊编辑部可代办邮购。订阅款请汇入：开户行：兴行吕岭支行，收款单位：中医药通报编辑部，帐号1293 001 001 000 40724。现金订阅请寄本刊编辑部，订阅人姓名、详细地址和电话，务必书写清楚。