免疫性卵巢早衰小鼠生殖能力的研究
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[摘要] 目的：探讨补肾复方左归丸对免疫性卵巢早衰（POF）小鼠动情周期、卵泡刺激素（FSH）、雌二醇（E2）、受孕率的影响。方法：以小鼠透明带3为抗原，皮下多点注射免疫BALB/c雌性小鼠建立免疫性卵巢早衰模型。设左归丸低、中、高不同剂量进行治疗，以泼尼松、己烯雌酚为阳性对照，观察动情周期、受孕率，ELISA法检测外周血清FSH、E2水平。结果：模型组小鼠动情周期紊乱，FSH增高，E2降低，受孕率低下。左归丸各剂量组动情周期时间延长，但仍有规律性变化。FSH升高及E2降低均不明显，受孕率也低下。结论：模型组卵巢功能损伤、破坏。左归丸能改善、保护卵巢功能，但对受孕率改善不明显。
[关键词] 卵巢早衰；左归丸；动情周期；FSH；E2；受孕率
[中图分类号] R711[文献标识码]A [文章编号]1673-7210（2008）02（c）-013-03
Reproductive capacity of immune premature ovarian failure mice
ZHU Ling, LUO Song-ping, XU Li-mian
（Department of Gynecology，The First Affiliated Hospital，Guangzhou University of TCM ，Guangzhou510405, China）
[Abstract] Objective: To probe the effect of Zuogui Pill (ZGP), a Chinese compound recipe for tonifying Shen, on estrous cycle, FSH、E2 and conception rate of mice. in mice with immune premature ovarian failure (POF).Methods:BALB/c female mice model of POF was established by multiple sites subcutaneous injection of zona pellucida 3 of mice, and treated with different dosage ZGP of low, middle and high one, with prednisone and diaethylstilbestrol as positive control. Observed estrous cycle of mice and conception rate. Detected FSH and E2 in peripheral blood serum by ELISA. Results:The estrous cycle of POF models were disorder. The level of FSH increased and E2 decreased. The conception rate become low. The period of estrous cycle prolonged in the mice of different dosage ZGP, but still kept regularity period. The change of FSH and E2 is not significant. The conception rate was lower also. Conclusion:The ovarian function is hurt and destroyed in immune POF mice. ZGP can improve and preserve the ovarian function, but not improve significantly conception rate.
[Key words] Premature ovarian failure; Zuogui Pill; Estrous cycle; FSH; E2; Conception rate
卵巢早衰（premature ovarian failure, POF）是指女性在40岁前出现卵巢功能衰退，主要表现为月经稀发或持续闭经，常伴烘热、多汗、失眠等躯体症状，及出现焦虑、抑郁、敏感、敌对、压抑，阴道干涩，痛、性生活不满意等不适[1]。骨质疏松、心血管疾病等患者发生可较自然绝经者提前10年，妊娠主要依赖卵子捐赠[2]，是一类严重影响妇女身心健康的疾病。左归丸具有补肾精、养精血、化瘀血之功，临床治疗卵巢早衰有一定的疗效[3]。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1动物SPF级BABL/c雌性小鼠110只，雄性小鼠20只，体重18～22 g，由广东省医学实验动物中心提供，动物合格证号：粤监证字2006A019，动物实验环境监测合格证号：粤监证字2006C082。雌、雄按6∶1的比例用有分隔的饲养笼饲养，以诱导小鼠的正常周期。每天阴道脱落细胞涂片，观察动物的周期。选择有规律动情周期的小鼠进行实验（以2个动情周期计算）。
1.1.2 药物与试剂
1.1.2.1小鼠透明带多肽溶液小鼠透明带3（ZP3）的第330～342个氨基酸序列（NSSSSQFQIHGPR），其分析纯度>95%，杭州中肽生化有限公司生产，批号：P00074。
1.1.2.2弗氏完全佐剂美国Sigma公司产品，批号：075K8915；弗氏不完全佐剂：美国Sigma公司产品，批号：105K8907。
1.1.2.3醋酸泼尼松片中山市三才医药集团有限公司生产，批号：200503116。
1.1.2.4己烯雌酚山东鲁抗辰欣药业有限公司生产，批号：051103201。
1.1.2.5左归丸由熟地24 g、山药12 g、枸杞子12 g、山茱萸12 g、川牛膝12 g、菟丝子9 g、鹿角胶12 g、龟板胶12 g组成，龟板胶由南方医院中药房提供，其余中药由广州中医药大学第一附属医院中药房提供。
1.1.2.6 其他FSH酶联免疫试剂盒(pg/ml)：批号：3332303EIA。E2酶联免疫试剂盒(pg/ml)：批号：311303EIA。以上试剂由美国UNIONHONEST 公司生产。
1.1.3 主要仪器酶标仪：德国BIO-RAD生产，Model：550。
1.2方法
1.2.1 POF模型制备称取2 mg ZP3透明带多肽粉末，加入2 ml三蒸水配成溶液，取1 ml溶液稀释至6 ml溶液，与弗氏完全佐剂按1∶1比例配制成免疫试剂，与弗氏不完全佐剂按1:1比例配制成免疫强化试剂。按文献方法造模[4]，每鼠取0.15 ml免疫试剂皮下多点注射双后脚掌及腹腔，14 d后以免疫强化试剂0.15 ml皮下多点注射小鼠双后脚掌及腹腔加强免疫。
1.2.2分组随机分为空白对照组、模型组、佐剂组、泼尼松组、己烯雌酚组、左归丸低剂量组、左归丸中剂量组、左归丸高剂量组。
1.2.3给药除空白对照组及佐剂组外，模型组及其余组小鼠于双后脚掌及腹腔皮下多点注射免疫试剂0.15 ml，空白对照组注射生理盐水0.15 ml，佐剂组注射弗氏完全佐剂0.15 ml；14 d后各组动物于双后脚掌及腹腔皮下多点注射新鲜配制的免疫强化试剂，空白对照组再次注射生理盐水0.15 ml，佐剂组注射弗氏不完全佐剂0.15 ml；第二次免疫后第6天各药物开始组灌胃给药。其中泼尼松按20 mg/(人・d)，根据小鼠与人的体表面积进行换算，用冷开水溶解药片，制成溶液，调整浓度，使每毫升溶液含泼尼松0.17 mg。己烯雌酚按1 mg/(人・d)，根据小鼠与人的体表面积进行换算，用冷开水溶解药片，制成溶液，调整浓度，使每毫升溶液含己烯雌酚0.009 mg。中药组除鹿角胶、龟板胶外，其余药物均水煎后去渣，纳鹿角胶及龟板胶烊化，浓缩，调配浓度，使低剂量左归丸溶液每毫升含生药0.5 g；中剂量左归丸溶液每毫升含生药1 g；高剂量左归丸溶液每毫升含生药2 g。每只小鼠灌胃量均为0.3 ml，空白对照组、模型组、佐剂组灌胃相同量蒸馏水。连续灌胃4周，每周休息1 d。
1.2.4动情周期观察从小鼠第一次免疫起，各组动物每天早上8:00进行阴道脱落细胞涂片观察动情周期的变化。小鼠动情周期为4～6 d，即每4～6天内出现动情前期、动情期、动情后期、动情间期的周期性变化，则记为一次规则的动情周期；如杂乱无章，或持续某一个时期无变化，则记为无规则动情周期，以6 d为界，如6 d以上，则以出现的天数除以6，折为无规则动情周期的次数。
1.2.5 FSH、E2检测于给药4周后眼眶采血，离心，取血清采用ELASA法检测，按试剂盒说明书操作。
1.2.6 妊娠率检测于第二次免疫后1周开始灌胃给药（同1.2.3），连续给药4周。将雌性小鼠与雄性小鼠以2∶1比例合笼饲养，每天观察动物的阴道栓，把有阴道栓的雌性小鼠取出，没有的继续雌雄合笼饲养，配种维持时间为4 d。3周后处死动物，解剖子宫，观察动物的妊娠率。
1.3统计学方法
采用SPSS 10.0统计软件，计数资料采用χ2检验，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，进行t检验。
2结果
2.1 免疫性POF小鼠的动情周期变化
免疫后，模型组小鼠逐渐表现为动情周期紊乱，仅有动情后期和动情间期，或仅有动情前期、动情期，或表现为持续的动情间期，阴道细胞涂片主要表现为大量白细胞及少量上皮细胞。己烯雌酚组也表现动情周期紊乱，主要为持续的动情期，阴道细胞涂片主要表现大量角化细胞。中药各组也有动情周期紊乱的表现，但主要为动情周期时间延长，仍有动情前期、动情期、动情后期、动情间期的规律性变化。
按免疫后1～14 d、15～35 d、36～55 d三个不同的时段及1～55 d整个时段统计有规则的动情周期及无规则的动情周期（表1），对结果进行χ2检验，其中1～14 d：χ2=20.715，P
2.2 免疫性POF小鼠FSH和E2的变化及左归丸的影响
模型组与空白对照组、佐剂组相比，FSH明显增高，E2明显降低，均有显著性差异。左归丸各剂量组FSH、E2与空白对照组、佐剂组相比差异无统计学意义，与模型组相比，FSH增高及E2降低均不明显，差异有显著性；各剂量组间无显著性差异。与泼尼松组相比，FSH增高也不明显，差异有显著性。泼尼松组与空白对照组相比，FSH明显增高，差异有显著性；与模型组相比，E2水平也明显增高，差异有显著性。己烯雌酚组与模型组相比，FSH增高及E2降低均不明显，差异有显著性。见表2。
2.3 免疫性POF小鼠的受孕能力及左归丸的影响
除空白对照组外，受试各组胎仔数均明显减少，与空白对照组相比差异显著，尤以模型组胎仔数减少最明显，差异最显著（P
与空白对照组相比：*P
3讨论
卵巢早衰内分泌特征主要表现为高FSH、低E2，其病因目前尚不清楚，尽管遗传学方面的因素及盆腔化疗、放疗、手术、吸烟等与POF有关，但仍有1/3～1/2的病例是特发的。此病部分患者可自发缓解，甚至受孕。激素替代治疗（HRT）是主要的治疗方法。POF患者卵巢活检表明卵巢局部出现活化T淋巴细胞浸润，卵泡上皮细胞表达HLA-DR和CD40[5]。自身免疫性卵巢疾病（autoimmune ovarian disease，AOD）被认为是导致人类POF产生的原因之一，但POF的免疫学基础至今还知之甚少[6]。有研究发现，POF具有肾虚血亏血瘀的病机特点[7]。
左归丸出自明代温补派名家张景岳的《景岳全书・新方八阵》，主要有滋肾阴、养精血的作用，兼具活血之功。张氏在《素问》“形不足者，温之以气；精不足者，补之以味”的基础上，受仲景肾气丸制方思想的启发，提出“善补阴者，必于阳中求阴，则阴得阳升而泉源不竭”的观点，创制“阳中求阴”的代表方左归丸体现其该学术观点，完善了补肾调阴阳平衡的理论。左归丸方中以熟地为君药，滋肾阴养精血；臣以山茱萸养肝滋肾、山药补脾益阴、枸杞子补肾益精，并在此草木并补肾肝脾三阴的基础上配伍龟、鹿二胶血肉有情之品，以填精补髓，滋生真阴，共助熟地滋肾阴养精血；佐以菟丝子温阳益阴，合鹿角胶，“阳中求阴”，使肾中的产生由阳气作为化生动力而源源不绝，佐川牛膝通利血脉，活血化瘀，补肾强腰。全方的配伍注重寓调节肾的阴阳平衡于补肾之中，以平为期，虽为补阴血之剂，然补阴之中寓有补阳之用，共达补肾精、养精血、化瘀血之功。临床上用此治疗围绝经期综合征，可消除烘热汗出、烦燥易怒、口干咽燥等症状，能增加阴道分泌物，改善外阴、阴道干涩症状，并有报道对雌激素水平不足的闭经也有较好的疗效[8]。
研究中发现模型组小鼠表现为喜欢扎堆，毛发松乱，易激惹，并出现动情周期紊乱；与空白对照组、佐剂组相比，FSH明显增高，E2明显降低，均有显著性差异。与空白对照组相比，胎仔数均明显减少，差异极显著（P
左归丸各剂量组也有动情周期紊乱的表现，但主要为动情周期时间延长，仍有较规律的变化。FSH、E2与空白对照组、佐剂组相比差异不明显，与模型组相比，FSH增高及E2降低均不明显，差异有显著性；各剂量组间无显著性差异。与泼尼松组相比，FSH增高也不明显，差异有显著性。左归丸各剂量组胎仔数与模型组相比有所增加，且存在一定的量效关系，但均与模型组相比无显著性差异，各剂量组间也无显著性差异。表明左归丸具有调节内分泌功能，减缓抗明带抗体所致的小鼠卵巢的损伤，对卵巢功能有一定的保护作用，但对小鼠的受孕率改善作用不显著，也许与用药时间较短有关。
佐剂组与空白对照组相比FSH、E2变化不明显（P＞0.05），但胎仔数也明显减少，差异有显著性。说明佐剂对卵巢功能也有一定的损伤。
泼尼松组与空白对照组相比，FSH明显增高，差异显著；与模型组相比，E2水平也明显增高，差异有显著性；与空白对照组相比胎仔数也减少，差异有显著性，幅度较模型组小，但无显著性差异。随机双盲法的病例对照研究表明运用GnRHa+促性腺激素治疗POF时，联合皮质激素使用有益于恢复卵巢的功能[9]。泼尼松对FSH改善不明显，对E2水平有一定提高，是否泼尼松组卵巢早衰处于较早期阶段，过高的FSH导致卵巢E2水平增加，有待进一步研究。
己烯雌酚组与模型组相比，FSH增高及E2降低均不明显，差异有显著性。与空白对照组相比胎仔数也减少，差异有显著性。表明补充雌激素可通过下丘脑-垂体-卵巢轴的负反馈机制抑制增高的FSH，改善生殖内分泌，但对抗明带抗体所导致的小鼠卵巢损伤改善不明显，受孕率低。
综上所述，模型组小鼠动情周期紊乱，FSH增高，E2降低，受孕率低下，卵巢功能损伤、破坏。左归丸能改善FSH、E2水平，表现为较规律的动情周期，但仍受孕率低下。其机制有待进一步研究。
[参考文献]
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[8]朱玲,陈彬彬,黄泉智，等．左归丸临床与实验研究进展[J]．国医论坛,2003，18(2): 51-53.
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（收稿日期：2007-01-07）
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