五味子木脂素与生态因子相关性研究

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[摘要]建立五味子中五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素4种成分的高效液相色谱测定方法，分析不同样地间气候因子和海拔高度对五味子木脂素类含量的影响，确定吉林省五味子最适栽培地区的气候特点。采用高效液相色谱法，Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相甲醇（A）-水（B）梯度洗脱，检测波长254 nm，柱温 35 ℃，流速1 mL・min-1，该测定方法重复性、稳定性和精密度均良好。并用SPSS软件分析气候因子和木脂素相关性，结果发现采集于吉林省集安市、柳河县、安图县和抚松县的五味子成熟果实中五味子醇甲质量分数均高于0.4%，达到质量要求，但是，五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素含量与样地海拔高度间呈明显的线性负相关关系，即随海拔高度增加呈下降趋势，特别是五味子醇甲的负线性拟合系数达到0.844 1，具有显著性，而五味子丙素与样地海拔高度的相关性不明显。与五味子木脂素中五味子醇甲、五味子乙素以及4种木脂素含量呈显著正相关的气候因子主要是温度因子（年均气温、7月最高温、7月平均温、1月最低温、1月平均温）和降水因子（年均降水量），说明较高的温度和降水量有助于五味子中木脂素的形成和累积。建议五味子栽培区域应尽可能选择在温暖多雨的低海拔地区。

[关键词]五味子；木脂素；高效液相色谱；含量测定；气候因子；相关性分析；最适栽培区域

[收稿日期]2013-10-17

[基金项目]吉林省医药产业发展重大专项（YYZX201007）；科技成果转化计划项目（20130305049YY）

[通信作者]杨利民，Tel：（0431）84533004，E-mail：

[作者简介]林红梅，硕士，讲师，主要从事药用植物资源生态方面研究，Tel：13504466604，E-mail： 五味子为木兰科植物五味子Schisandra chinensis （Turcz.）Baill的干燥成熟果实，主产于吉林、辽宁、黑龙江等地，习称“北五味子”，因其果实甘、酸、辛、苦、咸五味俱全而得名。是我国长期使用的补益类药物，应用历史已有2 000多年。具有收敛固涩，益气生津，补肾宁心之功效[1-3]。

大量研究证明，五味子中含有的联苯环辛二烯结构的木脂素类物质是其主要的生物活性成分[4-12]，主要包括五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素等，此类物质具有保肝、降酶、保护中枢神经系统、抗艾滋病毒和抗癌等多种活性[13-15]。在2010年版《中国药典》中， 以五味子醇甲作为五味子药材的质量控制指标， 其质量分数要求达到0.4%[1]。

中国东北是五味子的道地产区，目前有大面积栽培，虽然对栽培药材质量与生态环境关系的研究不少[16-18]，但针对五味子的报道却很少[19]。本研究采用HPLC，对来自吉林省4个产地的五味子样品中4种木脂素类物质（五味子醇甲，五味子甲素，五味子乙素，五味子丙素）进行含量测定，并分析不同产地间生态环境对五味子木脂素类物质含量的影响，为五味子的优质规范化栽培提供依据。

1材料

五味子样品于2010年9月果实成熟期采于吉林省集安市、柳河县、安图县和抚松县，样地选择尽量随机，如集安市样区尽管有2个样地海拔几乎相同，但实际两样地经纬度相差很远，故设置为2个点。集安市样区地处长白山脉中南段，在气候区划中属“潮湿森林气候带岭南暖温气候类型”； 抚松县样区地处长白山西北麓，在气候区划中属“潮湿森林气候带温和气候类型”；柳河县样区地处长白山脉西部，在气候区划中属“湿润森林气候带温暖气候类型”；安图县样区地处长白山北麓，在气候区划中属“湿润森林气候带温寒气候类型”[20]，样品采集点见图1。

五味子醇甲、五味子甲素对照品（批号分别为110857-200709，110764-201010）均购于中国食品药品检定研究院，纯度分别为97.3%，98.0%；五味子

图1五味子样品采集点位置图

Fig.1Location map of Schisandra chinensis sample

乙素、五味子丙素对照品（201006，201011） 购于四川省维克奇生物科技有限公司，纯度均≥98.0%。甲醇（色谱纯）美国Fisher公司，实验用水为高纯水，试剂均为分析纯。

Agilent 1100高效液相色谱仪（在线脱气机、四元泵、DAD检测器、手动进样器、HPChem station化学工作站），6202高速粉碎机（台湾原鑫田欣镇企业有限公司），PL203电子天平[0.001 g，梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司]， DL-820E智能超声波清洗器（上海之信仪器有限公司），RE-52A旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂），SHB-ⅢA循环水式多用真空泵（上海豫康科教仪器设备有限公司），101-1A型数量电热鼓风干燥箱（上海锦屏仪器代表有限公司通州分公司）。

2方法

2.1样品处理

不同样地五味子果实于40 ℃烘干、除杂、粉碎，过40目筛备用。精密称取各调查样地五味子粉末1.000 0 g，置于50 mL 锥形瓶中，加甲醇约45 mL 超声提取（35 ℃，90 kHz）20 min，放冷，摇匀，过滤后加甲醇于50 mL量瓶定容，精密吸取20 μL 进行液相测定。

2.2色谱条件的选择

色谱柱采用Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm， 5 μm） ，检测波长254 nm，柱温 35 ℃，流速1 mL・min-1，流动相甲醇（A）-水（B）梯度洗脱，见表1。取对照品和样品注入高效液相色谱仪，进样量20 μL，所有样品均需经过0. 45 μm微孔滤膜过滤，对照品、样品色谱图见图2。

2.3混合对照品溶液的配制

精密称取经五氧化二磷干燥后的五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素对照品适量，配成质量浓度为五味子醇甲0.25 g・L-1、甲素0.048 g・L-1、乙素0.1 g・L-1、丙素0.016 g・L-1的混合对照品溶液。

2.4方法学考察

2.4.1线性关系考察分别吸取配制好的混合对

1.五味子醇甲；2.五味子甲素；3.五味子乙素；4.五味子丙素。

图2对照品（左）和样品（右）的HPLC色谱图

Fig.2HPLC chromatogram of reference substance（left） and chromatogram of Schisandra chinensis（right）

照品溶液2，4，8，12，16，20 μL，按照色谱条件进样，测定峰面积。以色谱峰面积为纵坐标（Y），混合对照品溶液进样量为横坐标（X），绘制标准曲线，以峰面积对质量浓度进行线性回归，计算回归方程、线性范围及相关系数，见表2。结果表明4种木脂素对照品品溶液的含量在各自线性范围内与峰面积的线性关系良好。

2.4.2精密度试验取混合对照品溶液按色谱条件每次进样20 μL， 重复测定6次。计算4种成分峰面积，求出4种成分的相对标准偏差RSD（n=6）分别为：五味子醇甲0.9%，五味子甲素1.1%，五味子乙素1.0%，五味子丙素0.8%。结果表明所用仪器具有较好的精密性。

2.4.3稳定性试验精密吸取混合对照品溶液20 μL，按色谱条件每隔4 h进样1次，共测定6次。计算4种成分峰面积，求出4种成分的相对标准偏差RSD（n=6）分别为五味子醇甲1.9%，五味子甲素2.7%，五味子乙素2.0%，五味子丙素0.9%。结果表明供试溶液在制备后其成分含量在24 h内基本稳定。

2.4.4重复性试验取同一批五味子样品，在同样条件下分别称取样品6份，制成供试溶液后吸取20 μL，按色谱条件进样分析测定记录结果。根据4种成分峰面积计算其在样品中的含量，求出4种成分的相对标准偏差RSD（n=6）分别为：五味子醇甲2.9%，五味子甲素3.7%，五味子乙素2.8%，五味子丙素1.0%。结果表明本方法重复性良好。

2.4.5加样回收率试验准确量取已知含量的五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素标准品溶液20 μL，加入至1 g五味子样品中，按选定的样品制备及测定方法进行定量分析，测定上述4种成分的加样回收率分别为106.7%，109.6%，99.6%，104.6%，RSD分别为4.8%，4.3%，4.8%，3.2%，结果表明本方法的回收率较高，偏差较小，符合定量测定要求，准确度较高。

2.5样品中木脂素含量测定

取各样地五味子样品各3份（共63份），制成供试品溶液后进行高效液相分析，每次进样20 μL，按照选定的色谱条件进行测定，计算出每份样品中五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素的含量，见表3。

2.6五味子不同产地生态因子数据

利用ArcGIS为分析平台，以全国1 km2的气候栅格数据库（活动积温、年平均温度、7月最高温度、7月平均气温、1月最低气温、1月平均气温、年平均日照时数、湿度、年年均降水量）和1 km2的地形栅格数据库为后台数据，获取五味子不同采集处的生态因子值和高程值。

2.7不同产地间五味子品质与生态因子数据处理

五味子有效成分含量与气候因子相关系数、聚类分析采用SPSS 18.0软件分析进行。

3结果与讨论

3.1五味子果实中木脂素含量测定结果分析

各样地五味子果实4种木脂素类成分含量测定结果见表3。结果表明栽培在集安低海拔温暖区域的五味子药材质量最好，而栽培在抚松和安图较高海拔寒冷区域的五味子药材质量相对较差。但是，吉林省集安市、柳河县、安图县、抚松县4个五味子产地的样品中五味子醇甲含量均满足2010年版《中国药典》规定五味子醇甲需达到0.4%的要求，只有抚松县高海拔地区栽培的五味子品质略差。五味子果实中五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素与海拔高度关系拟合方程分别为：Y=-0.000 6X+0.896 4，Y=-0.000 1X+0.222 3，Y=-0.000 2X+0.432 9；拟合系数R2分别达到0.844 1，0.461 7，表明上述3种木脂素与样地的海拔高度间存在明显的线性关系，即随海拔高度上升呈明显的下降趋势，特别是五味子醇甲与样地海拔高度拟合系数远大于0.5达到显著水平，而五味子丙素与样地海拔高度没有明显的相关性。

3.2五味子果实中木脂素含量与生态因子相关性分析

利用SPSS软件对五味子样品品质和生态因子进行相关系数计算，见表4。结果发现，海拔与五味子中的五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素成分显著负相关，而与五味子丙素没有明显的相关性，并且海拔与4种木脂素含量和呈显著负相关。这与3.1中得到的结论一致，说明五味子栽培应选择低海拔区域以提高木脂素含量。另外，气候因子中除了日照与五味子中木脂素含量是负相关外，其他气候因子都是正相关，说明五味子栽培应注意避免太多日照时间。

五味子木脂素中五味子醇甲、五味子乙素以及4种木脂素含量和与气候因子有较强相关性；而五味子甲素和五味子丙素与气候因子没有相关性。与五味子醇甲显著正相关的气候因子有年均气温、7月最高温、7月平均温、1月最低温、1月平均温，说明温度高有助于五味子醇甲的形成和累积；与五味子乙素显著正相关的气候因子有年均气温、7月最高温、7月平均温、1月最低温、1月平均温和年均降水量，说明较高温度和较多降水量有助于五味子乙素含量提高；与4种木脂素含量和显著正相关的气候因子有年均气温、7月最高温、7月平均温、1月最低温、1月平均温和年均降水量，说明温度和降水有助于提高五味子中木脂素含量。

综上所述，五味子适宜栽培区域应选在低海拔、光照弱且温度较高、降水丰富区域，以有助于提高五味子中木脂素含量。

4结论

本研究采用高效液相色谱法，分别对吉林省4个产地的五味子成熟果实中4种木脂素类成分（五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素及五味子丙素）含量进行测定。采用该方法样品中各组分的色谱峰达到了基线分离，重复性好、灵敏度高，可用于五味子4种木脂素的定性与定量分析。测定结果表明，采集于吉林省4个县市的五味子样品中五味子醇甲质量分数均高于0.4%，达到《中国药典》（2010年版）质量要求[1]，仅有1个来自于高海拔的样品五味子醇甲为0.316 9%。从样品木质素类成分含量的变化规律上看，相对温暖而较低海拔的集安和柳河的五味子木质素含量较高，而来自于较寒冷高海拔的抚松和安图的五味子木质素含量相对较低，可见五味子果实中木质素含量与栽培区域环境具有相关性。通过4个县17个样地五味子4种木质素含量与样地海拔高度的相关性拟合分析，结果表明五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素的含量与样地海拔高度间呈明显的线性负相关关系，即随样地海拔高度的增加呈明显的下降趋势，特别是五味子醇甲与海拔高度的负线性相关拟合系数达到0.844 1，具有显著性，而五味子丙素与样地海拔高度的相关性不明显。

五味子木脂素中五味子醇甲、五味子乙素以及4种木脂素含量和与气候因子有较强相关性；与五味子醇甲、五味子乙素、4种木脂素含量呈显著正相关的气候因子主要是温度因子（年均气温、7月最高温、7月平均温、1月最低温、1月平均温）和降水因子（年均降水量），说明较高的温度和降水量有助于五味子中木脂素的形成和累积。

五味子木脂素与年均日照呈负相关，说明五味子栽培应注意避免太多日照时间。

综上所述，建议五味子最适栽培区域应尽可能选择在温暖弱光照、降水充沛的低海拔地区。

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