免疫层析技术在病原体及药物残留检测方面的研究进展
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摘要:免疫层析技术作为一种新型的诊断方法,因其灵敏度高、特异性强、方便快速、低价等优点已在病原体、药物残留检测方面得到广泛应用。本文主要对近几年免疫层析技术研究与应用方面取得的进展及存在的问题作以综述。
关键词:免疫层析;胶体金;药残
中图分类号:S852.5+5文献标识码:A
文章编号:1674-0432(2010)-05-0027-2
一、概述
免疫层析技术作为一种诊断方法最早是由Kohn在19世纪60年代提出,并在80年代初期发展起来。该技术的基本原理是以条状的纤维层析材料作为固相载体,通过毛细作用使待检样品溶液在纤维层析条上移动,同时使样品中的待检物与层析材料上针对待检物的受体(如抗体或抗原)发生高特异性、高亲和性的免疫反应,在层析反应的过程中免疫复合物被滞留或富集在层析材料上的检测区域,通过酶反应或直接运用可目测的标记物(如胶体金、乳胶颗粒等)而出现可直观观察到结果。该技术稳定性、重复性好,不需要特殊仪器与熟练操作的技术人员,非常适于一线工作人员在基层使用,可以作为一种快速的现场诊断方法使用。免疫层析技术是目前发展最快的复合型免疫层析技术,经过几十年的发展,作为一门成熟的体外诊断技术已广泛地应用于生物、医学、兽医等领域的检测,特别是以该技术为基础研发的试纸条以其便捷、快速、准确和无污染等特点越来越受到人们的重视,已被大量应用于医学检验、临床诊断及药物残留检测等。
(一)病毒检测
病毒性疾病是兽医临床最常遇到的疾病,围绕病毒性疾病开发免疫层析诊断方法具有十分重要的意义。猪轮状病毒是引起猪腹泻的三大病毒之一,严重威胁着养猪业的发展。J.H.Kang等人研发的猪轮状病毒VP6单克隆抗体免疫层析胶体金双夹心检测试纸条以猪轮状病毒VP6两种特异性抗体mAb-1和mAb-2。mAb-1作为捕获蛋白、mAb-2作为探针蛋白固定在试纸条检测区域,最小检出菌量可达103PRV,而且该胶体金试纸条的检测结果与RNA PCR检测方法一致性达100%。口蹄疫是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的牛、羊、猪等偶蹄类动物的高度接触性急性传染病。兰州兽医研究所蒋涛等人利用免疫层析技术研制的O型FMDV病原定型诊断胶体金试纸条可直接检测出水疱皮及水疱液中的口蹄疫病毒,灵敏度与特异性试验结果显示最高可检测到1:256倍稀释的O型标准抗原,灵敏度略高于反向间接血凝试验。对感染非O型的口蹄疫病料定型检测结果均为阴性,且与临床症状相似疾病的病原无交叉,无假阳性反应,特异性高。除此之外,目前还研制出犬细小病毒、伪狂犬病毒、新城疫病毒等免疫层析胶体金诊断试剂条用于病毒的检测。
(二)细菌检测
金黄色葡萄球菌可以产生多种肠毒素,可引起胃肠炎。蛋白A是该菌在其对数生长期分泌到细胞壁外的特殊产物。Su-Hua Huang等人研制的金黄色葡萄球菌蛋白A免疫层析胶体金试纸条将胶体金溶液与抗蛋白A抗体形成的结合物固定在试纸条的检测区域,羊抗兔的抗体作为对照线,将待检测的食品经过处理后滴加在试纸条的样品垫上,如果样品中含有金黄色葡萄球菌在试纸条的检测区域将出现红色,检测时间只需25h,敏感性强,非常适用于现场检测。沙门氏菌可感染多种人和动物,针对沙门氏菌在我国流行的特点,周东明等人建立了快速检测鼠伤寒沙门氏菌的胶体金免疫层析法,并研制出了免疫层析胶体金试纸条用于食品中的鼠伤寒沙门氏菌的检测。试验结果表明沙门氏菌引起食物中毒的菌量一般在106-107cfu・m l-1以上,而用于检测沙门菌的免疫层析试条检测灵敏度为105cfu・m l-1, 在中毒菌量的检测范围内,随时随地都可直接检测出鼠沙门氏菌病原体,整个操作过程只需要5-10min,肉眼可观察到检测结果,适合于基层单位使用。除此之外,已有检测霍乱弧菌、单增李斯特菌等免疫层析胶体金试剂条用于生产实践。
(三)寄生虫检测
牛的巴贝虫病在热带和亚热带地区严重威胁着家畜生产,可直接感染家畜的脾脏,引起家畜的溶血性贫血、黄疸、血红蛋白尿,甚至可引起家畜的急性死亡。血清学涂片显微镜检测一直是常规的检测方法,但不适合大量的样本检测。Chulmin Kim等人建立了Rrap-1/CT抗体免疫层析胶体金法检测牛巴贝虫病,具有很高的特异性,无交叉反应。人感染旋毛虫的病例在中国的西北部持续增长,疾病的发生与缺乏有效的诊断方法密切相关。免疫层析法检测肌肉活组织中旋毛虫是一个很重要的工具。崔晶等人建立了肉类旋毛虫感染的快速免疫学检测方法并研制了免疫层析胶体金试纸条。该试剂条胶体金结合垫上SPA抗原可捕获人和其他哺乳动物IgG的Fc片段,不仅可以检测出猪的肌肉活组织的旋毛虫而且还可以检测出人及其他哺乳动物肌肉组织中的旋毛虫,已用于新鲜肉、冷藏肉及冻肉中抗旋毛虫的检测。
三、免疫层析技术在药物残留检测方面的应用
盐酸克伦特罗,俗名“瘦肉精”,是一种β-兴奋剂。如果将其作为饲料添加剂可提高瘦肉率,但其残留在动物组织中会对食用者的肝、肾等内脏器官产生毒害, 出现心悸、头痛、目眩、恶心、呕吐、心率加快、肌肉振颤等症状,严重者甚至死亡。目前国内检测盐酸克伦特罗的常用方法有很多,但各自存在缺点。张慧嫦等人研制的盐酸克伦特罗免疫层析胶体金试纸条将抗盐酸克伦特罗单克隆抗体-胶体金复合物包被在胶体金结合垫上,并将人工合成的盐酸克伦特罗抗原包被在硝酸纤维素薄膜表面作为检测线(T线),其与待测样品中盐酸克伦特罗竞争结合胶体金标记的盐酸克伦特罗单克隆抗体,并能以颜色直观显示检测结果,其灵敏度的最低值可达到0.5ng/ml。氯霉素作为一种高效广谱抗生素,常用于动物各种传染性疾病的治疗,但残留在动物肉、奶、蛋等食品中的氯霉素对人和动物机体有很大的毒副作用。我国自主研制的氯霉素免疫层析胶体金检测试纸条可用于饲料、水产品、牛奶等产品中氯霉素的检测,最低检测含量达到1ng/ml,并且只需10min就可出检测结果,费用低廉,而且不需要附加实验设备,能满足养殖场所等的检测需要。除此之外最近已有关于免疫层析胶体金试纸条检测磺胺类等药物的报道。
四、结语
免疫层析技术是体外快速诊断技术的重要的发展方向,近年来该技术发展迅速,已在多个领域得到广泛应用,如传染病、早孕、癌症等的检测以及毒素、药残留、环境监测等。免疫层析胶体金试条因其使用方便已被广泛用于小分子物质的诊断检测,具有灵敏度高,操作快捷,不需要附加设备等优点,尤为重要的是特别适合基层单位现场的检测和诊断的使用。免疫层析技术的这些特点是其他方法不可比拟的。因此,可以说该技术不仅具有巨大的发展潜力,而且还具有广阔的市场和应用前景。
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作者简介:张林波(1973-),男,吉林农业大学生命科学学院副教授。研究方向:免疫学。
通讯作者:*张丹丹(1982-),女,白城师范学院生物系助教,研究方向:免疫学。