黄芪甲苷对心力衰竭大鼠心肌细胞凋亡的影响

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摘要：目的 观察黄芪甲苷对大鼠心肌细胞线粒体的保护作用及其抗心肌细胞凋亡的作用，探讨其治疗心力衰竭的机制。方法 SD大鼠60只随机分为空白对照组、模型组、黄芪甲苷组和曲美他嗪组。皮下注射异丙肾上腺素复制心衰模型，黄芪甲苷组每日给予黄芪甲苷50 mg/kg灌胃，曲美他嗪组每日给予盐酸曲美他嗪10 mg/kg灌胃，连续3周。实验结束时留取各组大鼠心肌组织，应用倒置荧光显微镜测定心肌细胞线粒体膜电位（MMP），免疫印迹技术测定心肌细胞端粒酶反转录酶（TERT）的表达，流式细胞术测定心肌细胞凋亡情况。结果 黄芪甲苷组心肌细胞MMP比值为3.226±0.371，显著高于模型组及曲美他嗪组（P

关键词：黄芪甲苷；心力衰竭；线粒体；细胞凋亡；大鼠

心肌重构是心力衰竭发生发展中的基础环节，神经体液机制在心肌重构中发挥着的重要作用[1]。国内外学者认为，神经体液机制引起的心肌细胞线粒体代谢障碍与损伤导致心肌细胞凋亡，而心肌细胞凋亡是心肌重构中的主要原因，促进了心力衰竭的进展[2]。因此，心力衰竭的发展过程就是线粒体损伤及功能紊乱的过程，线粒体是防治心力衰竭的重要靶点[3]。如何保护线粒体结构和功能，从而抑制心肌细胞凋亡，成为治疗心力衰竭的关键。黄芪甲苷是黄芪总皂苷中的主要成分之一，对乳鼠心肌细胞具有保护作用[4]，同时可以对抗急性心肌缺血再灌注损伤及急性心力衰竭[5]。本研究通过观察黄芪甲苷对大鼠心肌细胞线粒体的保护作用及其抗心肌细胞凋亡作用，探讨黄芪甲苷治疗心力衰竭的机制。

1 材料与方法

1.1 动物

清洁级SD大鼠，60只，体质量220～240 g，黑龙江中医药大学动物中心提供，动物合格证号：SCXK（黑） 2008-004。

1.2 药物、试剂与仪器

黄芪甲苷（黑龙江中医药大学药学院提供），异丙肾上腺素（Sigma公司，美国），盐酸曲美他嗪（施维雅制药公司，法国）。JC-1荧光探针线粒体膜电位（MMP）检测试剂盒、磷酸盐缓冲液、碘化丙啶（上海碧云天生物技术有限公司），兔抗端粒酶反转录酶（TERT）多克隆抗体、碱性磷酸酶标记山羊抗兔IgG、NBT/BCIP显色试剂盒（北京中杉生物工程有限公司），PVDF膜（PALL Corporation，美国）。TE2000-s倒置荧光显微镜（尼康公司，日本），FACSCalibur流式细胞仪（BD公司，美国）。

1.3 分组、给药与取材

大鼠随机分为4组，每组15只。正常对照组给予蒸馏水灌胃，连续3周；其余大鼠每日45 mg/kg皮下注射异丙肾上腺素，连续2 d[6]；4周后应用彩色超声监测仪测量左室射血分数（LVEF），以LVEF≤45%为造模成功。模型组造模后每日给予蒸馏水灌胃，黄芪甲苷组每日给予黄芪甲苷50 mg/kg灌胃，曲美他嗪组每日给予盐酸曲美他嗪10 mg/kg灌胃；连续3周。实验结束时处死大鼠，立即摘取心脏，用预冷的生理盐水冲洗，切取心尖部心肌组织，部分直接用于实验，其余心肌液氮保存备用。

1.4 心肌细胞线粒体膜电位测定

分离各组所得心肌组织并获取单个心室肌细胞[7]，在线粒体膜电位较高时，JC-1聚集在线粒体的基质中，可以产生红色荧光；在线粒体膜电位较低时，JC-1不能聚集在线粒体的基质中，此时JC-1为单体，可以产生绿色荧光。按照心肌细胞MMP试剂盒说明书操作，应用倒置荧光显微镜观察并采集图像，Image-ProPlus图像分析软件分析图像，用红色与绿色荧光强度比值表示，比值低则受损严重。

1.5 流式细胞仪检测心肌细胞凋亡率

将各组实验所得心肌组织研磨并过滤，PBS洗涤后以75%乙醇固定，碘化丙啶染色，流式细胞仪检测凋亡率。

1.6 蛋白印迹检测端粒酶反转录酶表达

取液氮冻存心肌标本进行研磨，将研磨所得心肌组织按文献[8]进行SDS聚丙烯酰胺电泳，分离转膜，兔抗TERT多克隆抗体（1∶800）4 ℃过夜，碱性磷酸酶标记山羊抗兔IgG（1∶1000），37 ℃ 孵育1 h， NBT/BCIP显色5 min。β-actin为内参。

1.7 统计学方法

采用SPSS11.5统计软件进行分析。数据以—x±s表示，多组间均数比较采用方差分析，组间比较采用LSD法进行双侧检验。P

2 结果

2.1 黄芪甲苷对心力衰竭大鼠心肌细胞线粒体膜电位的影响（见表1）

3 讨论

心肌细胞线粒体在细胞凋亡过程中起启动作用， MMP下降是细胞凋亡早期的主要标志，抑制MMP的下降是阻断细胞凋亡的重要途径[9]。端粒酶可以阻止随着DNA复制和细胞分裂所造成的端粒的不断缩短，稳定染色体的长度，抑制细胞衰老凋亡。端粒酶还可以抑制线粒体内过氧化物的生成，保护并增强线粒体功能，抵制凋亡[10]。

TERT是具有催化活性的端粒酶蛋白亚单位。主要作用为阻止有丝分裂期后端粒酶活性的丧失，维持端粒的长度，延迟心肌细胞周期的退出。因此TERT是决定端粒酶活性的最重要的因素。TERT表达增加，可以促进心肌细胞增生，减少心肌细胞凋亡[11]。促进TERT表达成为保护受损心肌细胞的主要手段之一。

盐酸曲美他嗪于20世纪60年代应用于临床，近年来研究表明，其作为心肌细胞保护剂，可以保护心肌细胞线粒体功能，改善受损心肌细胞能量代谢结构，增加能量合成[12-13]。但在改善心脏血供、抗氧化、抗凋亡方面疗效并不确切。而大量研究显示黄芪甲苷具有抗氧化、抗自由基、抗凋亡、改善心肌供血及正性肌力作用[14-15]，还可以调节心肌细胞能量代谢[16]。

本研究表明，黄芪甲苷可以维持受损心肌细胞MMP的稳定性并促进TERT表达。在正常对照组中，TERT未见明显表达，受损后为维持心肌功能代偿增生，可见曲美他嗪组与模型组TERT表达出一定增殖活力，而黄芪甲苷组TERT明显表达，由此可知黄芪甲苷可以保护受损心肌细胞端粒活性，抑制心肌细胞凋亡促进增殖。同时受保护的端粒协同黄芪甲苷共同发挥保护心肌细胞线粒体的作用[10]。黄芪甲苷能够维持受损心肌细胞MMP的稳定性，提高心肌细胞端粒活性，及其调节能量代谢，改善心肌供血共同作用以抑制心肌细胞凋亡，其作用效果明显优于曲美他嗪。

本研究通过荧光显微镜技术及免疫印迹技术观察黄芪甲苷对心肌细胞MMP的影响及促进心肌细胞TERT表达作用，表明黄芪甲苷能够保护心肌细胞线粒体，抑制心肌细胞凋亡，保护心肌细胞，这可能是中药单体治疗充血性心力衰竭机制之一。

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