微生物天然产物早期鉴别及去重复方法研究进展
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摘要：微生物天然产物具有独特的结构多样性。随着研究的深入，研究者在进行天然产物筛选时遇到已知化合物的机会加大，有必要在研究的早期对粗提物中的化合物进行早期鉴别及去重复，以减少不必要的人力、物力及财力的浪费。文章对涉及天然产物早期鉴别及去重复的方法——薄层层析技术（TLC）、高效液相色谱（HPLC）-光谱联用技术及天然产物数据库在天然产物早期鉴别及去重复中的应用进行综述，以期为新药的研究与开发提供一些借鉴。
关键词：微生物天然产物；早期鉴别；去重复；薄层层析；液相色谱-光谱联用技术；数据库
中图分类号：TQ028.8 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）22-5409-06
20世纪20年代弗莱明博士从青霉菌中发现青霉素揭开了有目的地利用微生物次生代谢产物的序幕。经过80多年的研究，目前已经报道的具有生物活性的微生物次生代谢产物达到了20 000个以上[1]。其中，一些具有重要的生物活性的微生物天然产物已被开发成为医药、农药[2-4]，如青霉素、头孢菌素、他汀类药物、环孢菌素A、阿维菌素、Strobilurin类杀菌剂等，在农药及医药中占据了相当大的比重。微生物天然产物成为新药开发的重要源泉。尽管跨国医药企业在20世纪90年代对天然产物研究与开发的兴趣曾经一度下降，但由于组合化学及高通量筛选并未为其带来预期的结果，这些企业对天然产物的研究已经在复苏，天然产物在新药的研究与开发中发挥着重要的作用[5-10]。
据估计，开发一种新药平均要花10～15年的时间，总费用已超过10亿美元[11]。在从微生物天然产物中进行药物筛选研究时，研究者经常会碰到已知的化合物或不感兴趣的化合物。为了避免不必要的人力、物力及财力的浪费，研究者应尽可能在研究的早期对微生物粗提物中的化合物进行初步鉴别，排除其中的已知化合物或重复的化合物。微生物天然产物早期鉴别及去重复的一般流程见图1。以往人们利用纸层析、薄层层析进行微生物天然产物的早期鉴别及去重复。目前，高效液相色谱（HPLC）已广泛应用于微生物天然产物的早期鉴别及去重复，与高效液相色谱技术联合使用的现代分析技术的发展，使微生物天然产物的早期鉴别及去重复更为方便。而天然产物数据库的建立，则大大简化了微生物天然产物的早期鉴别与去重复的过程。本研究对用于微生物天然产物的早期鉴别及去重复的方法进行总结，以期对微生物天然药物的研究与开发提供一点借鉴。
1 薄层层析
微生物在次生代谢过程中产生复杂的次生代谢产物。这些复杂组分的物理化学性质不同，其在不同的溶剂系统中扩散的速度不同。用于微生物次生代谢产物分离的材料包括纸、硅胶、氧化铝等。事实上，从20世纪40年代开始纸层析技术就被用于微生物产生的化合物的早期鉴别与去重复。在20世纪80年代，Zahner等[12]根据不断增加的薄层层析（TLC）色谱及显色剂知识，提出了一个基于薄层层析的微生物天然产物的筛选策略——化学筛选。微生物提取物经薄层硅胶层析展开后，可在紫外及可见光下记录层析样品的层析情况；另外，利用多个显色剂对层析后的样品进行显色。通过与数据库中已知化合物进行对比，可初步确定样品中的化合物是否为数据库中的化合物。该方法在德国汉高研究所（HKI）和HOECHST制药公司得到运用，利用该方法对8 000株微生物进行了筛选，分离到259个化合物，其中129个化合物是新结构化合物。新化合物分离的比率达到50%[13]。云南大学微生物研究所李铭刚等[14，15]通过与HKI合作，利用其TLC数据库对一株嗜碱放线菌的次生代谢产物进行了早期鉴别，从中分离到了两个活性化合物。Filtenborg等[16，17]也采用TLC方法，结合可见光、紫外线及显色剂，对真菌产生的毒素进行了筛选。但是该方法的最大缺陷是分辨率不高、自动化水平不高，特别是对一些未知化合物缺乏有效的鉴别手段，对化合物的快速鉴别依赖于数据库中化合物的数量。
2 液相色谱（LC）技术与光谱技术联用
20世纪60年代末至70年代初，科克兰（Kirkland）等人开发了世界上第一台商业高效液相色谱仪，开启了HPLC时代[18]。随着技术的发展，如柱料的改进、高压泵的应用，HPLC技术的分离效果提高迅速，而与计算机联用则大大提升了高效液相色谱的自动化程度。LC技术已广泛应用于生物活性物质的分离、纯化。将具高分离性能的LC技术与能够获取丰富化学结构信息的光谱技术相结合，通过一次或少数几次分析即可全面地获得整个微生物粗提物的化学组成、含量及结构等信息，在研究的早期即鉴别或鉴定出化合物的结构及预测出新化合物的存在，达到对生物活性物质进行快速筛选的目的，大大促进了微生物来源的有生物活性的新化合物的发现。
2.1 与紫外光谱联用（LC-UV）
微生物粗提取物通过色谱柱分离后，含有某一特定化合物的流动相在通过光电二极管阵列检测器时，计算机的色谱工作站可获得这一化合物的紫外光谱图。色谱工作站可将获得的紫外图谱存储在计算机中，并可与建立的已知或标准化合物的紫外图谱库进行比对，快速确定该化合物是否为已知化合物。此外，紫外光谱还可提供一些被检测的化合物的结构信息。液相与紫外光谱技术的联用，已广泛应用于微生物天然产物的化学筛选，研究者利用这一手段结合生物活性筛选，从微生物中发现了一些新的生物活性化合物[19-31]。德国Goettingen大学的Laatsch教授研究小组建立了天然产物标样及分离的天然活性化合物的紫外图谱库，用于微生物天然产物的早期鉴别与排重。受到资源的制约，这种自建的数据库中化合物的数量相对较小。丹麦理工大学的研究者建立了自动比较LC所得到的化合物紫外图谱的方法，并利用此方法发现了两个新的化合物[32，33]。随着LC技术的发展，超高效液相色谱（UPLC）在微生物天然产物分析中的应用越来越广泛。利用UPLC与光电二极管阵列检测器联用，可更为迅速地进行微生物粗提取物中化合物组成的分析[34]。光电二极管阵列检测器的缺点在于不能检测不具有发色基团的微生物天然产物。此外，由于可供分析的已知化合物的数量有限，采用此种方法能够剔除的仅为已有的化合物。
2.2 与质谱联用（LC-MS）
质谱仪具有灵敏度高的特点，通常可检测到纳克乃至皮克级的化合物，可获得被检测化合物的分子量与结构信息。高分辨质谱（MS）还可确定被分析的化合物的分子式。与LC联用的质谱仪包括：单四极杆、串联四极杆、离子阱及飞行时间质谱（高分辨）仪等。Fredenhagen等[35]建立了以LC-离子阱质谱仪联用来快速有效地鉴定微生物提取物中原来已分离鉴定的化合物的方法。采用LC-MS对微生物发酵提取物中的化合物进行分析，通过与该数据库中已知天然产物的母离子MS数据进行比较，基本上可以确定微生物发酵提取物中是否有新的化合物。Si等[36]采用LC/ESI-MS/MS对来源于藤黄灰链霉菌发酵液的次生代谢产物进行化学筛选，鉴定出了46种异戊他定系列氨基寡糖类成分，其中41种为新化合物。在该LC-MS分析结果的指导下分离得到了其中11个化合物的单体，经核磁共振（NMR）分析等手段确认了它们的结构，均与LC-MS提示的结构相一致。Feistner[37]采用液质联用对Erwinia属细菌的代谢物组成进行了分析。Nielson等[38]利用液相色谱-紫外与高分辨飞行时间质谱，建立了一个快速有效的鉴别真菌次生代谢产物及其分子组成的方法。Kim等[39]利用液质联用对4株Myxococcus xanthus的次生代谢产物进行了鉴别，从中发现了一个新化合物Myxalamid K。而利用超高效液相色谱-质谱联用，可以更加快速地对微生物提取物中的化合物进行鉴别。Berrue等[40]利用UPLC-MS建立了Erythropodium caribaeorum珊瑚的主要代谢产物的UPLC-MS数据库。利用UPLC-MS，他们从该珊瑚的附生微生物中快速筛选到了产生目标化合物的微生物菌株。Ito等[41]利用UPLC-MS对16 025个微生物提取物进行了分析，利用ACD IntelliXtract软件对得到的液质分析数据进行了处理，从提取物中发现了38 000多个不同的化合物峰。而将这些化合物的相关信息整合，形成了一个数据库[41]。德国的Goettingen大学建立了1 000多个微生物天然产物的ESI MS/MS数据库，用于化合物的早期鉴别[42]。还有的研究者利用电喷雾质谱仪直接进样，对微生物提取物的化合物组成进行分析[43-45]。
由于质谱仪本身的局限性，其所得到的结构信息不足以解决化合物的鉴定问题；另外，不同的化合物对离子化条件要求不同；与液相联用时对流动相的要求较高，不宜使用不挥发性缓冲盐。因此，单纯依赖LC-MS联用仍不能解决微生物天然产物的早期鉴别与去重复等问题。
2.3 与核磁共振谱联用（LC-NMR）
NMR技术是用于结构鉴定的最为有效的手段。将NMR与LC结合起来，利用LC对化合物的高效分离，对目标化合物的结构进行鉴定。LC-NMR的操作模式有3种：连续流（Onflow）、停流（Stopped flow）及峰贮存（Loop-storage）[46，47]。NMR的灵敏度相对质谱来说较低，通常最低只能检测微克级的样品。但是随着技术的进步，在LC与NMR联用的硬件及软件方面取得了显著进展，如核磁共振仪的磁场强度达到900 A/m，专为联用设计的流通探头、毛细管探头、超低温探头等，可提升检测的灵敏度，在某些模式下可以检测微克以下的样品[42，48，49]。NMR可以获得所分析化合物的部分甚至是全部结构信息，可在研究的早期确定所研究的化合物是否为已知化合物或初步确定新化合物的结构。该技术目前已经应用于微生物天然产物粗提物的早期鉴别与去重复[42，48，50，51]。该方法还存在一些不足，主要表现在：①灵敏度仍然较低；②对复杂的样品分析存在难度（主要是色谱分离）；③溶剂峰的影响。这些都还有赖于仪器技术进步来解决。
2.4 液相与多种光谱技术联用
将高效液相色谱与多种光谱技术联用，可同时获得所分析化合物较为完整的各种信息。不同的光谱技术的联合运用，可弥补LC与单一光谱技术联用所存在的缺陷，获得微生物粗提物中化合物较为完全的结构信息，结合数据库检索，可快速确认目标化合物是否为已知化合物或新化合物[52，53]。Lang等[42，48]建立了液相与多种光谱技术联用的真菌提取物中已知化合物去重复的方法。对具有抗细菌、抗真菌或细胞毒性的真菌或细菌提取物，先采取LC-UV分析，并结合生物测定，对得到的活性峰对应的紫外光谱和保留时间与建立的已知化合物紫外光谱数据库进行比较。如果未发现匹配的化合物，则将得到的质谱和（或）紫外信息输入到MarinLit或Antibase等数据库中进行查询。对仍然不匹配的化合物，则将根据1H NMR图谱解析得到的部分结构信息输入到Anti/Marin数据库中进行检索，可快速确定化合物是否为已知化合物。利用该方法，他们从一株内生真菌中鉴定出Phomosine A、Phomosine C及其他的Phomosine衍生物。
3 天然产物数据库在早期鉴别及去重复中的应用
一旦对微生物粗提物进行了各种分析，并获得了一些与其结构相关的信息后，如何快速有效地确认其是否为已知化合物是研究者所要解决的首要问题。利用这些数据与信息，若直接从文献（论文及专利）中查找则费时费力。为了快速地鉴别微生物粗提物中的化合物，可利用一些公共数据库，如SciFinder、ChemBank、ChemID、PubChem等[54]。但是这些公众数据库只能提供化合物的名称、结构、化学特性、用途、生物学活性等。这些在线的公众数据库在确定一个已明确结构的化合物是否为新化合物时非常方便。但是这些数据与通过仪器分析所得到的数据不能很好地衔接。
目前，用于微生物天然产物早期鉴别与去重复的数据库主要是一些专业的商业数据库，包括The Dictionary of Natural Products、Antibase 2012、Berdy Bioactive Natural Products Database、UMEZAWA DB、MarinLit等。此外，商业化合物数据库，如CAS、Reaxys也包含了大量的天然产物的数据[54，55]。由Chapman&Hall开发的Dictionary of Natural Products可提供DVD版及网络版，其最新版中包含了23万多个天然产物的化学、物理及结构数据，如化合物的精确名称及通用名、分子式、分子量及元素组成、化学结构、紫外及化合物来源、化合物的物理性质（如熔点、沸点、旋光性、生物活性及毒性等），基本包含了Berdy Bioactive Natural Products Database的信息。该数据库每半年更新一次[56]。Antibase数据库由德国Gottingen大学Laatsch教授领导的团队开发，Wiley出版集团发行，为软件版。该数据库包含了30 000多个微生物来源的产物，包括了微生物天然产物的分子式、分子量、元素组成、理化性质、光谱数据、生物活性数据及来源（含相关的文献），并能够提供结构查询。该数据库为每年更新一次[57]。日本在微生物天然产物的研究与开发方面开展了大量的工作，也开发了一些专门针对微生物天然产物的数据库。日本北里大学北里研究所微生物化学实验室开发的新北里化学数据库，包括了16 000种微生物次生代谢产物，该数据库可与DOS兼容，包含了化合物的物理化学性质，但是没有化学结构[58]。日本的Bioscience AssociatesTM开发的基于Microsoft Office Acess的UMEZAWA DB，其前身为ActFund，包括了16 000多个微生物天然产物的物理、化学及生物学特性，可采用紫外、分子量及分子式进行查询[59]。日本理化研究所（RIKEN）开发了一个微生物天然产物数据库，包括16 000多个化合物，可提供化合物名称、结构、分子式、分子量、产生菌、生物活性及化合物的基本特性等[60]。MarinLit由新西兰Canterbury大学开发并维护，该数据库收集了约22 000个海洋天然产物的相关信息，其中包含了一部分海洋微生物天然产物的信息[42]。该大学与德国Goettingen大学合作，将MarinLit数据库与Antibase数据库整合，形成了一个包括50 000多个化合物的数据库AntiMarin。该数据库中可提供1H NMR图谱所推导的结构信息的查询，每年更新一次[42]。中国医学科学院药物所于20世纪80年代开始，逐步建立了基于Foxbase的微生物产物数据库MPMS。2000年后通过与上海创腾科技合作，利用MDL公司的ISIS化学信息管理系统作为开发平台，对原有的数据库进行了更新，开发了新一代的微生物天然产物数据库（MNPD）。该数据库收集了微生物天然产物共15 000多个，主要包括微生物天然产物的名称、分子式、分子量、结构类型、CAS登记号、颜色、晶型、熔点、旋光度、溶解性、紫外和红外特征吸收峰等重要理化性质、微生物天然产物的产生菌、制备方法及生物活性、相关原始参考文献及专利信息[61]。还有研究者根据研究所得到的数据自主进行天然产物数据库的开发。Lopez-Perez等[62]开发了一个包含6 000多个天然产物的13C图谱的数据库NAPROC-13，可用于已知天然产物的快速结构鉴定，也可为未知化合物的结构解析提供帮助。
4 结语
微生物天然产物仍将在新药研究与开发中发挥重要的作用。而在研究的早期对已知化合物进行有效鉴别与去重复是发现具有新结构的活性化合物的关键。结合活性筛选，运用薄层层析、液相-光谱联用，在研究的早期获得微生物粗提物中的活性化合物的相关信息，并通过数据库比对，可快速进行已知化合物的鉴别与去重复，并加速新活性化合物的结构解析。但是所有的技术都有其局限性，前文谈到了各种技术都存在这样或那样的问题，任何单一的技术都不可能完全解决微生物粗提物中所有的化合物的早期鉴别与去重复，特别是那些极微量的化合物。而针对这些技术的改进，将极大地促进具有新结构的微生物源生物活性天然产物的发现，从而推动药物研究开发与新药创制。
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