黄芪失笑散对实验大鼠梗死心肌内VEGF及bFGF mRNA基因表达的影响
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摘要：目的：黄芪失笑散对梗死心肌内血管内皮细胞生长因子(VECF)及碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)mRNA基因表达影响。方法：取SD大鼠76只，随机分成假手术组、模型组、消心痛组、黄芪失笑散小剂量组、黄芪失笑散大剂量组、消心痛加黄芪失笑散大剂量组、贝复济组。治疗20天后进行冠状动脉结扎造成急性心梗的模型，造模成功后再治疗10天后，处死大鼠，取梗死心肌用RT―PCR法进行VECF及bFGFmRNA的检测。结果：黄芪失笑散大剂量可有效的使梗死心肌内的VEGF及bFGF的mRNA表迭升高，并提示黄芪失笑散疗效呈剂量依赖性。结论：黄芪失笑散对缺血性心肌保护作用源于冠脉循环血管新生。
关键词：黄芪失笑散；冠脉结扎；VEGF；bFGF；基因表达
中图分类号：R259.14
文献标识码：A 文章编号：1673―7717(2008)01―0041-03
目前用基因促血管生成成为治疗冠心病一种新型方法。但是目前用基因促进血管生成方法面临一系列问题。诸如：可促使肿瘤细胞的增殖和肿瘤的演进；可使糖尿病视网膜病变加速恶化；可能增加脑缺血时脑水肿发生等。笔者在临床应用黄芪失笑散过程中发现该方能显著改善冠心病患者的胸闷、胸痛、心悸、气急等症状，考虑可能具有对缺血心肌的保护作用。为此使用该方观察其对梗死心肌内VEGF及bFGFmRNA基因表达以阐明本方的作用机理。
1 实验材料
1.1 实验动物及分组给药6周龄清洁级健康雄性sD大鼠76只，体重(2∞±20)g，由浙江中医药大学动物实验中心提供。随机分成假手术组(A组)、模型组(B组)、消心痛组(c组，12rag・kg・d，相当于成人用药剂量的20倍)、黄芪失笑散小剂量组(D组，14g・kg・d相当于成人用药剂量的10倍)、黄芪失笑散大剂量组(E组。28g・kg・d相当于成人用药剂量的20倍)、消心痛加黄芪失笑散大剂量组(F组，12mg・kg・d+28g・h.d)、贝复济组(C组)共7组。假手术手，模型组以等量的蒸馏水灌胃，贝复济组不予处理。
1.2 药品与仪器黄芪失笑散(由黄芪30g，蒲黄20g。五灵脂20g组成，浓缩成2g／mL的生药煎剂)：由浙江中医药大学附属广兴医院中药制剂室提供。消心痛：购自江苏方强制药厂。贝复济(外用重组牛碱性成纤维细胞生长因子)：珠海亿胜生物制药有限公司。TTC(氯化一235三本基四氮唑)：宏博公司分装。trizol、逆转录、PCR扩增试剂拿、琼脂糖、DNA-Mark均由上海生物工程有限公司提供。DH一150型动物人工呼吸机：浙江大学仪器厂。Medlab―U／4CS生物信号采集处理系统：南京美易科技有限公司。751型冷光单孔手术灯：上海医疗器械股份有限公司。RF－540荧光分光光度计：日本岛津公司。DU-600蛋白核酸分析仪：美国Benchman公司。PE4800型PR循环仪：美国PE公司。镝－型电泳仪：美国Bio一拉德公司。凝胶成份分析系统：美国Bio一拉德公司。
2 实验方法
2.1 心肌缺血的模型的制备各组按上述剂量灌胃，分每日2次，治疗20天，进行冠状动脉结扎。方法如下：大鼠用戊巴比妥钠腹腔注射，待麻醉后，将四肢与生物信号采集仪连接，连续记录心电图Ⅱ直至手术结束，并予以气管插管后接动物人工呼吸机供开胸后进行人工呼吸，进行开胸。切开胸膜、心包膜，暴露心脏，用细小弯针在冠状动脉左前降支下穿一丝线结扎，以缝线下方心肌色泽变浅、苍白。同时心电图见R波振幅明显抬高，出现sT段弓背向上明显抬高，为结扎成功。贝复济组在结扎后立即在结扎处周围予重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)喷洒1揿(125AU)，并予以肝素皮下注射1次／天(1250U／jg)，共5天，然后逐层关胸，术后予以青霉素预防感染。假手术组在开胸后不结扎冠脉，而仅在相应部位用无创缝针空穿1次即缝合胸壁在造模成功后，分别再灌胃lO天。10天后处死大鼠，迅速打开胸腔取出心脏快速洗净血液，剪去心房，沿房室沟将心肌平行切成约Imm宽的条带放在TIC溶液中4rMn左右取出吸干水分，分离出梗死区的心肌进行称重，记下重量，放在冻存管保存在液氮中。
2.2 RT―PCR法检测梗死心肌内vegf及bfgf mrna表达①梗死心肌内总RNA提取：按照Trizol试剂盒说明操作。在核酸紫外分析仪上测定RNA浓度及OIY260／OIY280，确定RNA纯度并每次行之前参照文献[8]将上述RNA行1.7％琼脂糖凝胶电泳以检测有无降解。
②引物设计PCR引物由PRIMER5软件自行设计，上海生工合成，设为B―actin内参照。引物序列及产物长度如下：bFGF280bp上游引物：5’GCGTGGACGGCGTCCGG-GAG 3’，下游引物：5’GGCCCCGrlTIGGATCCGAG 3，B―actin 240 bp上游引物：5’CACGGAGGGGCCGGACTCATC 3’，下游引物：5’TAACCTCTATGCCAACACAGT 3，VEGFl31bp上游引物：5’CAGCTATrGCCGTCCAATrGA 3，下游引物：5’CCAGGccllxarcAll。
③逆转录：按照逆转录盒说明书操作，产物作为PCR反应的cDNA模板。
④PCR扩增：取逆转录产物2.5p,L作为模板进行扩增，反应体系为50ul。PCR反应条件：预变性95℃。5min一变性95℃，30s一退火bFGF 66℃；B―actin 60℃：VEGF 62℃，30s－延伸72℃，Imin，共35个循环。
⑤电泳：取10ulPCR产物加入2ul溴酚蓝，在1.7％琼脂糖凝胶上电泳，以凝脉成像分析系统观察结果并摄像，测定各泳道样品光密度值，计算目标基因与B―actin产物光密度比值，以此值反映各样品中VEGF及bFGFmRNA的相对表达量的差异。
2.3 统计方法所有数据以均数±标准差(x±s)表示。应用SPSSll.5统计软件进行单因素方差分析比较各组间差异。
3 结果
3.1 黄芪失笑散对大鼠一般状况的影响实验的过程中，观察到服用黄芪失笑散的大、小剂量组、消心痛加黄芪失笑散大剂量组的大鼠，在毛色上比较光滑润泽；在喂养期间比较好动活跃，在结扎过程中服中药各组出现心律失常的机会少或短暂的出现心律失常后大多数可恢复窦律；尤其在冠状动脉结扎后，服中药组在苏醒时间、精神状态的恢复及胸部伤口愈合时间均比模型组、消心痛组、假手术组要短；处死大鼠时发现服中药组在心腔内的血栓形成的机会均比模型组、假手术组及消心痛组要少。
3.2 黄芪失笑散对VEGF及bFGF mRNA的影响见表1.图1－3。
用于冠脉结扎大鼠共76只，其中饲养、灌胃过程中死亡1只(解剖发现食管被穿破，药物进入气管造成窒息死亡)，用于假手术组8只均存活，其余各组存活6-7只，手术24h内死亡29只，死亡率为43.28％。
4 讨论
缺血心肌侧支循环的建立主要有两个过程：血管增生和血管重构。增生有两种方式：毛细血管生成和血管形成，前者指在已存在的血管上，以出芽的方式长出新的毛细血管，该过程依赖内皮细胞的有丝分裂。VEGF和bFGF均能特异地作用于血管内皮细胞，刺激其增殖，促进血管形成。从而改善组织器官的血液供应。
大量实验研究证明：心肌缺血缺氧时，VEGF和bFGF及其受体表达明显增加，促进机体缺血区侧支循环的建立。中医认为“气血互根、脉为血之府”，研究表明，补气话血与行气活血方药具有促血管生成作用。如：汪姗姗等报道麝香保心丸(由麝香、人参提取物、牛黄、肉桂、苏合香、蟾酥、冰片组成)能促进牛肾上腺微血管内皮细胞增殖并形成管腔结构，还能促进Wistar大鼠心肌梗塞边缘区VEGF、bFGF及Ⅷ因子的表达增多。王宗仁等芪丹通脉片(有黄芪、当归、丹参、红花、桂枝组成)能够预防急性心肌缺血；刺激心肌分泌VEGF和bFGF从而起到对缺血心肌保护作用。
黄芪失笑散是由黄芪合用失笑散而成，在治疗上以大剂量黄芪补气，失笑散活血化瘀以达到益气活血化瘀的目的，临床用于改善气虚所致心胸隐痛、胸闷气短、动则益甚、倦怠乏力等症状。
本实验结果显示，大剂量黄芪失笑散可有效使梗死心肌内VEGF及bFGFmRNA表达升高，与贝复济组比较无显著性差异；黄芪失笑散大剂量组与消心痛组、黄芪失笑散小剂量级比较有显著性差异，分析可能与消心痛易耐受有关，也可能黄芪失笑散具有消心痛所不具有功效，也说明黄芪失笑散促血管生成具有剂量依赖性。
综上述，笔者分析黄芪失笑散对缺血心肌的保护作用与心肌缺血时侧支循环的血管新生有关。