益气补肾法对自然流产模型小鼠脾T淋巴细胞亚群的影响
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摘 要：目的：将中医的益气补肾法应用于小鼠自然流产模型，观察其对自然流产模型小鼠脾T淋巴细胞亚群的影响。方法：性成熟的雌性CBA小鼠40只、雄性DBA/2小鼠20只，8～10周龄,建立自然流产小鼠模型，分四组：阴性对照组、中药组、环孢素组、中西医结合组。于孕第9天、14天，用颈椎脱臼法分批处死小鼠，用75%的乙醇消毒后，钝性分离皮肤及腹膜，取脾脏，制成单细胞悬液，采用流式细胞术分析T淋巴细胞亚群的表达情况。结果：实验方对孕早期脾脏CD4+T细胞表达具有下调作用，且具有统计学上意义（P 0.05），对孕早期脾脏CD4+T/CD8+T表达具有下调作用趋势，但不具有统计学上意义（P> 0.05），对孕中晚期脾脏CD4+T、CD8+T、CD4+T/CD8+T无明显调节趋势。结论：益气补肾中药在免疫细胞分子学水平对母胎免疫具有一定的调节作用。
关键词：益气补肾法；自然流产模型；脾脏
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1673-7717(2012)01-0100-04
Influence of Kidney-Qi-Nourishing Therapy on T Lymphocyte Subgroupof Spleen in Natural Abortion Model Mice
CHEN Lijuan1, WANG Xiangqun1, Advisor: YE Ping2
(1. Yuhang Hospital Affiliated to Hangzhou Normal University, Hangzhou 311100, Zhejiang, China;2. First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310006, Zhejiang, China)
Abstract:Objective:To obserue the influence of the kidney-Qi-nourishing therapy on the natural abortion model mouse spleen T lymphocyte subgroup. Methods：Natural mature female CBA mouse 40, male DBA/2 mouse 20, 8~10 week aged, established mouse model of spontaneous abortion. They were divided into four groups: negative control group, Medicines, cyclosporine group, Section of Integrative Medicine. On the 9th and 14th day of pregnancy,mice were sacrificed by cervical dislocation. After 75% ethyl alcohol disinfection, the passive separation skin and the peritoneum was made to take the spleen, makes the single cell to hang the fluid, and use the class type cell technique to analyze the T lymphocyte subgroup expression situation. Results: The solid proven prescription for pregnant early spleen CD4+ the T cell expression has the decline function, and has statistics significance (P0.05), for pregnant mid and late stage spleen CD4+ T, CD8+ T, CD4+ T/CD8+ the T expression has no obvious adjustment tendency. Conclusion:Kidney-Qi-nourishing medicine has a certain effect on the level of immune cells on the maternal-fetal immune regulatory.
Key words:kidney-Qi-nourishing therapy;Spontaneous abortion; spleen
自然流产指妊娠在28W以前自然自行终止，胎儿体重在1000g以下者，发生率为15%～25%。若连续2次或2次以上的自然流产，可称为反复自然流产(recurrent or repetivitive spontaneous abortion RSA),发生率为0.4%～0.8%[1]。虽然目前免疫性反复自然流产的疗法众多，但是西医各种免疫治疗有输血过敏反应、感染、激发和加重自身免疫性疾病等潜在危险。寻求疗效好，不良反应小的药物将有良好的医学、社会、经济效益。
本课题选择在母胎免疫中起重要作用的T淋巴细胞亚群，CD4＋、CD8＋T细胞为观察指标，将益气补肾中药应用于小鼠自然流产模型，以流式细胞术（FlOW cytometry，FCM）探讨其对模型小鼠脾脏组织CD4＋T、CD8＋T细胞的表达情况，以及观察对妊娠结局的影响。从而探讨益气补肾中药在母胎免疫中的作用机制，为临床用药提供理论依据。为发挥中医药的传统优势，更有效地治疗反复自然流产，进一步探讨其治疗机理，本实验以补中益气汤为基础方，加用菟丝子，将中医的益气补肾之法应用于小鼠自然流产模型，观察其对自然流产模型小鼠脾T淋巴细胞亚群的影响，从免疫细胞分子学水平探讨益气补肾中药对母胎免疫作用的机理，以及观察对妊娠结局的影响。
1 实验研究
1.1 实验动物和材料
1.1.1 实验动物
①品种及数量：性成熟的雌性CBA小鼠40只、雄性DBA/2小鼠20只，8～10周龄。
②提供单位：由浙江中医大学动物实验中心代购于上海西普尔-必凯实验动物有限公司。
③动物使用许可证号：SCXK（沪）2008-0016。
④动物饲养环境：清洁级；（25±1）℃；50％~70%相对湿度；每小时换风15～20次；150～200Lx的光照，12h明暗交替；噪音
⑤饲料及饮水：全价营养颗粒饲料（购于南京安立默科技有限公司）。动物饮水为城市自来水用净水器过滤后装入消毒过的饮水瓶内自由饮用。
⑥其它：实验前，不加任何干预，将小鼠饲养1周，使其很好地适应环境。
1.1.2 实验药品
①生理盐水（0.9%NS）:购于浙江省中医院西药房，中国广州百特医疗用品有限公司生产。批号:GS0808014。
②CSA溶液:商品名为：新山地明，25mg×50粒，瑞士诺华制药生产，批号为：S0072。原品为软胶囊，内容物为淡黄色油状液体。溶液制备方法为：先制备0.1%的甲醇溶液（0.1mL的无水甲醇加入99.9mL的蒸馏水中），避光保存，灌胃前1～2h将CSA胶囊放入装有25mL甲醇溶液的小烧杯中，待胶囊软化后，用1mL针筒的针头将其刺破，使内容物充分溶于甲醇溶液，待用。
③实验方：实验方药及剂量：黄芪36g，党参12g，当归6g，陈皮12g，升麻12g，柴胡12g，白术18g，菟丝子30g（补中益气汤为主加菟丝子）。上述生药均购于浙江省中医院中药房。制备方法如下:各药按比例称取，置于瓦罐中，加水适量，浸泡30min。先用武火加热煮沸，再改用文火煎30min，滤出药液。再向药渣中加入适量清水煎煮1次，滤出药液。将两次药液混合，放入烧杯中加热，精确浓缩至每毫升药液含生药2g。然后贮于消毒容器中，密封，放置于4℃冰箱中备用（浙江中医药大学实验室提供）。每次给药前，取出适量药液，加热至室温，其余仍保持于冷藏状态。
1.1.3 实验试剂
①PE Conjugated anti-mouse CD3e：美国eBioscience公司生产。产品编号：12-0031-81。产品批号：E030114。
②FITC Conjugated anti-mouse CD4：美国eBioscience公司生产。产品编号：11-0041-81。产品批号：E030114。
③Phycoerythrin-Cy5(PE-Cy5) anti-mouse CD8a(Ly-2)：美国eBioscience公司生产。产品编号：15-0081-81。产品批号：E026284。
④小鼠淋巴细胞分离液LTS1092：天津TBD灏洋生物制品科技有限责任公司生产。产品批号：20090515。⑤RPMI-1640培养液:内含300mg/L谷氨酰胺，2g/L碳酸氢钠，Millipore 0.22μL滤膜过滤除菌，pH值：7.2±0.2，内毒素≤0.1ng/mL，吉诺生物医药技术有限公司生产，产品批号：09032705。⑥
磷酸盐缓冲液(PBS溶液)：Millipore 0.22μL滤膜过滤除菌，pH值：7.2±0.1，吉诺生物医药技术有限公司生产，产品批号：09101902。
⑦D-Hank’s液：吉诺生物医药技术有限公司生产，批号：08102905。
1.1.4 主要实验设备和仪器
①漩涡混合器：XW-80A型，上海医科大学仪器厂。
②低速自动平衡离心机：LDZ5-2型，北京京立离心机有限公司。
③冷藏冷冻箱：BCD-208A/D型，中国海尔集团。
④光学显微镜：CX31RTSF型，日本OLYMPUS公司。
⑤微量移液枪：0.1-5000μL，德国Eppendorf公司。
⑥流式细胞仪：Facs Calibur基本型，美国BD公司（Becton， Dickinson and Company）。
⑦血球计数板：XB-K-25型，上海求精生化试剂仪器有限公司。
1.2 实验方法与步骤
1.2.1 建立自然流产小鼠模型
将雌性CBA/J与雄性DBA/2小鼠以2∶1比例合笼，每日晨8∶00-9∶00检查雌鼠阴道。若见到阴栓，则造模成功，视为孕0天；未见到阴栓，则继续合笼。
1.2.2 实验分组
①阴性对照组（生理盐水）：于妊娠第0天开始，以10mL/kg的剂量灌服NS。
②中药组（益气补肾中药）：于妊娠第0天开始，以27g/kg（临床用量的10倍）的剂量灌服实验方。
③环孢素（CSA）组：于妊娠第4天，以10mg/kg的剂量灌服CSA溶液。
④中西医结合组（中药＋CSA）：于妊娠第0天开始，以27g/kg的剂量灌服实验方；于妊娠第4天，以10mg/kg的剂量灌服CSA溶液。
1.2.3 实验步骤
动物实验在浙江中医药大学动物实验中心进行，设施条件合格证号：SYXK(浙)2008-0115。于孕第9天、14天，用颈椎脱臼法分批处死小鼠(先以摘眼球法取血，供实验二用)，用75%的乙醇消毒后，钝性分离皮肤及腹膜，取脾脏，制成单细胞悬液，采用流式细胞术分析T淋巴细胞亚群的表达情况。
①制备脾脏单个淋巴细胞悬液:
取出小鼠脾脏后，将其用PBS液冲洗1遍,置于加有2mL RPMI-1640培养液的培养皿中，左手持一把小镊子夹住脾脏，右手用1mL的注射器抽取平皿内液体缓缓注入脾脏内，将脾细胞冲洗出来，如此反复冲洗，直到脾脏变白为止。用微量移液枪转移细胞悬液至事先加入等体积小鼠淋巴细胞分离液的试管中，以2000r/min的速度离心15min后，用移液枪吸取云絮层溶液（即淋巴细胞层）至加有4mL D-Hank’s缓冲液的试管内，1500r/min离心10min，弃上清液，加入1mLPBS缓冲液反复冲打，离心洗涤2次。用血球计数板计数细胞，并调节细胞浓度至1×107/mL，制成脾脏单个淋巴细胞悬液，待检。
②细胞染色和流式细胞分析术（FCM）分析：
每次取100μL上述悬液，标准化法标记细胞，具体单抗添加方法见表1。
加抗后，用漩涡混合器振荡，促进细胞和单抗充分反应，避光孵育30min，再以PBS缓冲液洗涤1次，然后将细胞重悬于500μL PBS液中，即刻上机，用Cell Quest软件获取细胞,每份样本检测1×105个细胞, 结果以CD4＋T细胞占CD3＋T细胞的百分比、CD8＋T细胞占CD3＋T细胞的百分比、CD4＋T细胞/CD8＋T细胞的百分比来计算。测试完毕后用Cell Quest Pro软件分析数据。
1.3 统计学方法
所有资料用均数()±标准差(S)表示，组间比较应用单因素方差分析，进一步两两比较应用LSD-t检验，SPSS 13.0统计分析软件处理数据，P
2 实验结果
2.1 一般情况
观察小鼠精神状态、活动情况、饮食、二便、毛发光泽度等情况正常。
2.2 各组脾脏T细胞组成的差别
2.2.1 各组CD4＋T细胞占CD3＋T细胞的百分比含量
以CD4+作为特异性标记，进行脾脏细胞分选。孕9天时，与阴性对照组相比，中药组CD4＋T细胞占CD3＋T细胞的百分比明显减低，且具有统计学意义（P< 0. 05）（表1）。CSA、中西医结合组与阴性对照组相比，CD4＋T细胞占CD3＋T细胞的百分比也均降低，有明显的下降趋势，但不具有统计学意义（P> 0.05）（表1）。各治疗组按CD4＋T细胞占CD3＋T细胞的百分比由低到高排序，依次为：中药组、中西医结合组、CSA组，各组间无明显差异（P> 0.05）。孕14天时，各治疗组CD4＋T细胞占CD3＋T细胞的百分比无明显差异（P> 0. 05）（表3）。
2.2.2 各组CD8＋T细胞占CD3＋T细胞的百分比含量
以CD8+作为特异性标记，进行脾脏细胞分选。孕9天时，与阴性对照组相比，中药组CD8＋T细胞占CD3＋T细胞的百分比含量明显增高，有一定的上升趋势，但不具有统计学意义（P>0.05）（表2）。CSA组CD8＋T细胞占CD3＋T细胞的百分比含量无明显变化，且不具有统计学意义（P>0.05）（表2）。中西医结合组CD8＋T细胞占CD3＋T细胞的百分比含量有一定的增加，有明显的上升趋势，但不具有统计学意义（P>0.05）（表2）。各治疗组按CD8＋T细胞占CD3＋T细胞的百分比由高到低排序，依次为：中药组、中西医结合组、CSA组，统计学分析显示各组间无明显差异（P>0. 05）。孕14天时，各治疗组CD8＋T细胞占CD3＋T细胞的百分比无明显差异（P>0. 05）（表3）。
2.2.3 各组CD4＋T细胞/CD8＋T细胞的百分比
孕9天时，与阴性对照组相比，中药组CD4＋T细胞/CD8＋T细胞的百分比含明显减低，有一定的下降趋势，但不具有统计学意义（P> 0.05）（表2）。CSA组CD4＋T细胞占CD8＋T细胞的百分比含量稍有下降，且不具有统计学意义（P> 0.05）（表3）。中西医结合组CD4＋T细胞/CD8＋T细胞的百分比含显著减低，有一定的下降趋势，但不具有统计学意义（P> 0.05）（表2）。各治疗组按CD4＋T细胞/CD8＋T细胞的比值由低到高排序，依次为：中药组、中西医结合组、CSA组（表2、图2）。孕14天时，各治疗组CD4＋T细胞/CD8＋T细胞的百分比之间无明显差异（P> 0. 05）。
3 讨 论
雌性CBA小鼠与雄性DBA/2小鼠是经典的自然流产模型。其胚胎丢失率较其它小鼠所致的胚胎丢失率远远增高。近年来，国内外学者进行自然流产的实验研究，均以CBA×DBA/2作为模型使用。流式细胞术（FlOW cytometry，FCM）是利用流式细胞仪对生物颗粒（如细胞、微生物等）的多种物理和生物学特性进行定量分析，并对特定细胞群体加以分选的新的细胞参量计量技术，已被广泛应用与基础及临床医学研究中。
反复自然流产是妊娠期常见的一种并发症，其病因涉及遗传、免疫、内分泌及感染等多种因素。但在40％～60％病因不明的RSA患者中，多数是由于母胎免疫调节异常所致[8]。近年来的研究发现，T淋巴细胞及其亚群对胚胎在母体内免遭排斥及正常发育起着重要的免疫调节作用。CD3为T细胞表面重要的分化抗原；天然产生的CD4+CD8+T细胞是一群具有免疫调节功能的细胞，成为调节性T细胞（Regulatory T ceils, Treg），CD4+CD8+T细胞在自然条件下处于无能状态，具有自身免疫防御作用，即抑制其他CD4+T细胞和CD8+T细胞的活性能力，而且抑制作用是抗原非特异性的。该细胞可能通过细胞与细胞的直接接触发挥作用，并且其抑制作用与细胞表面的细胞毒素T淋巴细胞相关抗原4（CnA4）的表达密切相关。CD4+CD8+T细胞在不同种属存在进化保守性，人及鼠的CD4+CD8+T具有类似的表型和分布，能够广泛地识别各种不同的自身或外来抗原，在体外均具有抑制T细胞增殖和/或维持自身耐受的作用。
3.1 实验方对自然流产模型脾脏CD4＋T细胞的影响
孕早期（9天）时，自然流产模型脾脏CD4＋T细胞的表达情况：与阴性对照组相比，中药组CD4＋T细胞占CD3＋T细胞的百分比明显减低，且具有统计学意义（P< 0.05），说明实验方对孕早期脾脏CD4＋T细胞表达具有下调作用，提示CD4＋T淋巴细胞亚群比率降低，使母体细胞免疫功能减弱，对胚胎的免疫排斥反应减小，促进妊娠继续。而CSA、中西医结合组与阴性对照组相比，CD4＋T细胞占CD3＋T细胞的百分比也均降低，有明显的下降趋势，但不具有统计学意义（P> 0.05），提示CSA、中西医结合组虽然不具用统计学上意义，但下降的趋势，可能为样本量不足有关，同样可以促进妊娠继续。对各治疗组按CD4＋T细胞占CD3＋T细胞的百分比由低到高排序，依次为：中药组、中西医结合组、CSA组，各组间无明显差异（P> 0. 05），提示实验方在孕早期脾脏CD4＋T细胞表达具有下调作用比中西医结合组、CSA组更明显。孕中晚期（14天）时，各治疗组CD4＋T细胞占CD3＋T细胞的百分比无明显差异（P> 0.05），表明实验方对孕晚期脾脏无明显调节趋势。
3.2 实验方对自然流产模型脾脏CD8＋T细胞的影响
以CD8+作为特异性标记，进行脾脏细胞分选。孕9天时，与阴性对照组相比，中药组CD8＋T细胞占CD3＋T细胞的百分比含量明显增高，有一定的上升趋势，但不具有统计学意义（P>0.05）。CSA组CD8＋T细胞占CD3＋T细胞的百分比含量无明显变化，且不具有统计学意义（P>0.05）。中西医结合组CD8＋T细胞占CD3＋T细胞的百分比含量有一定的增加，有明显的上升趋势，但不具有统计学意义（P>0.05）。各治疗组按CD8＋T细胞占CD3＋T细胞的百分比由高到低排序，依次为：中药组、中西医结合组、CSA组，统计学分析显示各组间无明显差异（P>0. 05）说明实验方对孕早期脾脏CD8＋T细胞表达具有上调趋势，而且比中西医结合组CSA更明显，CD8＋T淋巴细胞占CD3＋T细胞的百分比的升高，CD8＋T淋巴细胞在机体免疫应答过程中起免疫负调节作用，被认为是抑制性T淋巴细胞，它既可以抑制由B细胞介导的体液免疫，也可以抑制CD4＋T淋巴细胞介导的迟发性超敏反应及增殖反应等，提示实验方优与中西医结合组 CSA组，有利于妊娠。孕14天时，各治疗组CD8＋T细胞占CD3＋T细胞的百分比无明显差异（P>0.05）提示实验方对孕中晚期脾脏CD8＋T无明显调节作用。
3.3 实验方对自然流产模型脾脏CD4＋T细胞/CD8＋T细胞的百分比变化的影响
孕9天时，与阴性对照组相比，中药组CD4＋T细胞/CD8＋T细胞的百分比含明显减低，有一定的下降趋势，但不具有统计学意义（P> 0.05）。CSA组CD4＋T细胞占CD8＋T细胞的百分比含量稍有下降，且不具有统计学意义（P>0.05）。中西医结合组CD4＋T细胞/CD8＋T细胞的百分比含显著减低，有一定的下降趋势，但不具有统计学意义（P>0.05）。CD4+/CD8+比例关系是机体免疫功能网络调控的重要枢纽，调控免疫进行的方向。各治疗组按CD4＋T细胞/CD8＋T细胞的比值由低到高排序，依次为：中药组、中西医结合组、CSA组。提示中药组CD4+/CD8+减低最明显，表明实验方对孕早期脾脏具有下调趋势。孕14天时，各治疗组CD4＋T细胞/CD8＋T细胞的百分比之间无明显差异（P> 0. 05），提示实验方对孕早晚期CD4+/CD8+无明显调节作用。
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