血栓的药效研究思路与方法

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（江西省妇幼保健院，江西 南昌 330006）

摘 要：对血栓的形成原因着手，阐述了血栓的药效研究思路与方法。

关键词：血栓；形成；药效

中图分类号：R364.1+5文献标识码：A文章编号：1673-2197（2009）01-0116-02

血栓是指机体血液中，由于血小板凝集或血液凝固等而在心血管内形成的固体。血栓症是一类严重危及人类健康及生命的的心血管疾病。现就其成因及药效研究阐述如下。

1 血栓形成的原因

19 世纪中期，Virchow[1] 首先提出血栓形成的三大因素：血液高凝、血流滞缓及血管壁损伤，经过百年来临床及多种检测手段的验证，Virchow 的理论已得到公认。

1.1 血管高凝

凝血是由系列凝血因子相继酶解激活，最终生成凝血酶和形成纤维蛋白的复杂过程，即所谓“凝血瀑布”。生理条件下，体内还存在与凝血系统相对的抗凝血系统，以保证在少量凝血因子被激活的可能下，不致发生连锁凝血正反馈反应。血液中重要的抗凝血因子主要有肝素、抗凝血酶Ⅲ（AT-Ⅲ）、蛋白C系统和组织因子途径抑制物（TFPI）等。血液凝固性增加表现为机体凝血功能亢进或抗凝功能降低，是血栓形成的直接原因之一。

1.2 血流异常

血流是影响血栓形成及其性质的重要因素，如在血流缓慢的静脉所形成的血栓，称为红色血栓；而在血流较快的动脉形成的血栓，称为白色血栓。血流异常主要涉及血液黏度增高和血流方式的异常。

1.3 血管内膜受损

生理状态下，血管内皮细胞具有强大的抗血栓形成的功能。正常的血管内皮细胞既能生成和释放使血管松弛的物质，如前列环素（PGI2）和内皮松弛因子（EDRF）；又能生成和释放抑制血小板粘附和聚集的物质，如PGI2、EDRF和6-酮-PGE1、13羟十八碳二烯酸；以及多种抗凝血酶的物质，如硫酸乙酰肝素、抗凝血酶（AT）、凝血酶调节蛋白（TM）和TFPI。此外，血管内皮细胞还能合成和分泌组织型纤溶酶原活化剂（t-PA）和尿激酶型纤溶酶原活化剂（u-PA），二者可与纤溶酶的集合在血管内皮细胞表面，使纤溶活性增高，以清除正常血液循环中形成的少量纤维蛋白。此外，血管内皮细胞还可产生纤溶酶原活化剂抑制剂（PAI），使已形成的血栓不被溶解，有利于血栓形成[2]。在炎症和致动脉粥样硬化等多种因素的刺激下，血管内皮细胞可出现凋亡。凋亡的血管内皮细胞不但失去抗血栓形成的功能，还能通过磷脂酰丝氨酸（PS）表达增加失去膜磷脂不对称性和抗凝膜成分丢失，进而促进血栓形成。内皮细胞可因物理、化学、生物、免疫等因素受到损伤，造成功能失衡，结果使内皮细胞的抗栓功能减弱，引起血栓形成。

2 研究思路

根据血栓形成的三大因素：血液高凝、血流滞缓及血管壁损伤，其药效研究分为以下三个方面。

2.1 降低血液高凝状态

凝血过程按照启动方式及参与的凝血因子可分为内源性凝血途径和外源性凝血途径。体内抗凝系统大致可分为两方面：细胞抗凝机制和体液抗凝机制。细胞抗凝机制是单核-巨噬细胞系统对激活的凝血因子、组织因子、凝血酶原复合物及可溶性纤维蛋白的吞噬作用。体液抗凝系统中较重要的有AT-Ⅲ、蛋白C抗凝体系等。

2.2 改变血流速度

2.2.1 抑制血小板活化

病理情况下，血小板在病变血管部位蓄积致血管闭塞，引起缺血性组织损伤和血栓栓塞症，因此抑制血小板活化是抗血栓的重要一步。调节血小板功能概括起来包括花生四烯酸系统、环核苷酸系统和Ca2+。

2.2.2 调节纤溶

纤溶是指纤维蛋白、纤维蛋白原被纤溶酶水解的过程，其主要作用是将沉积在血管外的纤维蛋白溶解，防止血栓形成。

（1）纤溶酶原激活剂。在体内最基本的纤溶酶原激活剂是组织型纤溶酶原激活剂和尿激酶型纤溶酶原激活剂。其主要功能是将纤溶酶原激活成纤溶酶，启动纤溶系统。

（2）纤溶抑制物。体内纤溶抑制剂包括纤溶酶原激活抑制剂和纤溶酶抑制剂两类，对纤溶系统起着重要调节作用。所以，提高纤溶酶原激活剂含量和减少纤溶抑制物含量，对抗血栓有重要意义。

2.3 避免内皮细胞受损

在生理情况下，完整无损的血管内皮细胞具有抗栓功能。因此避免内皮细胞受损，是研究抗栓药物的重要内容。内皮细胞产生的与血栓有关的物质主要有PGI2、EDRF与ET、vWF、TM、硫酸乙酰肝素与AT-Ⅲ、纤溶酶原激活剂与纤溶抑制物。

3 研究方法

3.1 实验动物的选择

各种血栓模型以大鼠最为常用，其次是兔和小鼠。对于器官血栓，也可选用大鼠、犬或者兔。

3.2 动物模型

3.2.1 光化学引起的大鼠局部脑血栓模型[3]

手术方法：麻醉后，仰卧固定大鼠。将大鼠头部右侧卧位，从左眼和左耳之中点，做突向耳侧长约2. 5cm 的弧形切口，分离颞肌，自颧弓前、后端剪断并剪断冠状突。分离周围软组织暴露和颧弓相接的颞鳞骨。在颧弓与颞鳞骨交界的前下方用台式牙科钻车行颅骨钻孔，用血管钳扩大骨窗暴露左侧MCA 近侧段主干，保持硬膜完整。个别大鼠MCA 变异，如无明确主干或在嗅束水平就已分离则放弃不用。完全暴露大脑下静脉和嗅束之间MCA 段后，先用湿生理盐水棉球盖住伤口待用，再做左侧股静脉插管备用。

血栓形成方法：选用激光如He2Ne和静脉注射光敏剂如血卟啉衍生物。经投射孔径将3mm 的光导纤维引出并固定于架上，投照孔径对准嗅束和大脑下静脉间的MCA，纤维远端距MCA约2mm，投照光能量密度大于640mW/ cm2 。激光照射MCA 同时，经股静脉插管缓慢注射12.5mg/kg体重血卟啉衍生物，注射时间超过1min，直接照射15min。在手术显微镜（Opton，West Germany） 下观察到MCA 血流中断并变为白色，即为血栓形成。

3.2.2 开颅电凝阻断模型[4]

手术方法：麻醉后，固定大鼠，沿眶上缘作弧形切口，分离眶内结缔组织后，可见视神经孔，电凝切断视神经，在视神经孔外上方开窗，切开硬脑膜，即可看到大脑中动脉，电凝并切断大脑中动脉起始部至大脑下静脉之间或者嗅束内侧2至大脑下静脉之间的一段大脑中动脉，敷少许青霉素钠后逐层缝合颞肌和皮肤。术后用加热垫维持动物体温在37～ 38℃，苏醒后送回原笼内。

3.2.3 化学法血栓模型[5]

手术方法：大鼠腹腔注射20%乌拉坦麻醉（5 mL•kg）。常规气管插管，行人工呼吸，然后开胸断第3、4肋骨，暴露心脏，打开心包膜，将吸有50%三氯化铁溶液的滤纸片贴于大鼠的冠状动脉前降支根部，2 min后大鼠腹腔注射氨甲苯酸（100 mg•kg），60 min后取下滤纸片。

3.2.4 光―色素法动脉血栓模型[6]

手术方法：大鼠用戊巴比妥钠麻醉，气管插管、颈动脉插管做血压监测。开腹，置肠系膜于生理盐水恒温槽中灌流，在显微镜下观察肠系膜微循环状况，经显微―摄像―录像系统拍摄在正常状况下微血管的流态。5m in 后打开荧光显微镜激发光光路，使特定波长的激发光照射在选定的目标血管段上，第6min 通过静脉插管注入荧光素钠FINa（2mL/kg），并以此时刻作为血栓模型建立的起始时间。在显微镜下或监视器上观察血栓生成的全过程并录像，直至血栓完全栓塞目标血管。

3.2.5 静脉血栓模型[7]

手术方法：动物麻醉剂864麻醉后，于右侧腹股沟区沿股动、静脉走行切开皮肤8 cm，钝性分离皮下及肌肉组织，充分暴露股静脉，于远端上动脉夹后切开股静脉，向心方向安置自制螺旋铜丝进入股静脉内并缝合，去静脉夹，手术视野检查无渗血，术毕。

3.2.6 小鼠角叉菜血栓模型[8]

造模：精密称取角叉菜胶，以生理盐水配成4%浓度，给大鼠称重，于后足跖部皮下注射角叉菜胶，剂量为20 mg/ kg 体重。

3.3 检测指标的选择

（1）内皮细胞功能测定：6-酮-PGE1a、NO与ET-1、VWF、TM测定。

（2）血小板功能测定：血小板黏附、聚集、释放功能的测定、TXB2测定。

（3）凝血因子和抗凝物质测定：凝血时间测定、凝血酶原时间、凝血酶时间测定、组织因子测定、AT-Ⅲ测定、蛋白C活性测定、组织因子抑制物活性测定。

（4）纤维蛋白溶解活性的检测：D-二聚体测定、组织性纤溶酶原激活剂测定、纤溶酶原激活剂测定。

（5）血液流变性测定：黏度测定、红细胞比容检测、红细胞沉降率测定、红细胞电泳时间测定、红细胞变形性测定。

（6）血栓相关指标测定：血栓重量、长度与血栓形成百分率、血栓形成时间、血流量、梗死面积或重量等。

参考文献：

［1］ Hansson PO，WelinL，Tibbin G. Deep vein thrombosis and pul2monary embolism in the general population［J］ . Arch Intern Med，1997，29（3） ：263.

［2］ 陈颂.血管内皮细胞凋亡研究进展［J］.Chinese journal of Thrombosis and Hemostasis，2001，2（7）：88-90.

［3］ 管兴志 .光化学大鼠大脑中动脉血栓形成模型的改进［J］.国外医学脑血管疾病分册，2000，8（5）：278-280.

［4］ 张玉勋.局灶性脑缺血大鼠模型的研究［J］.上海实验动物科学，1999，19（2）：96-101.

［5］ 任开环.重组水蛭素抗大鼠冠状动脉血栓形成的作用研究［J］.医药导报，2005，24（5）：369-372.

［6］ 万海同.应用光―色素法动脉血栓模型研究养阴益气活血冲剂的抗血栓作用［J］.中国中医基础医学杂志，2000，6（12）：47-49.

［7］ 安锐.99mTc-SZ-51用于犬静脉血栓模型放射免疫显像的研究［J］.临床心血管病杂志，2000，16（12）：554-556.

［8］ 丁书文 .白酒对角叉菜胶所致大鼠尾部血栓形成的影响［J］.中国预防医学杂志，2004，5（3）：161-163.