荭草提取物的肠外翻吸收研究

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[摘要] 利用肠外翻模型研究荭草提取物不同剂量在大鼠不同肠段的体外肠吸收特征。采用UPLC-MS/MS检测不同肠段中原儿茶酸，异荭草素，荭草素，牡荆素，木犀草苷，槲皮苷及山柰素鼠李糖苷含量，比较荭草提取物中各化学成分在各肠段的吸收情况，并计算提取物中各成分的吸收参数，用SPSS 13.0统计学软件对数据进行分析处理，分析考察对吸收参数影响的显著性，进一步分析其在不同部位的吸收特征。荭草提取物不同浓度时原儿茶酸等7种成分在不同肠段的吸收均为线性吸收，其回归相关系数（R2）均大于0.95，符合零级吸收速率，肠吸收速率（KA） 随着荭草提取物浓度增加呈线性增加（R2>0.95），表明各成分以被动扩散机制吸收；所考察成分在不同肠段肠囊的吸收速率存在不同程度的差异，各成分在各肠道的吸收趋势为十二指肠、空肠、回肠大于结肠。肠囊对荭草中化学成分的吸收透过有选择性，外翻肠囊法可评价其多成分的肠吸收特性。

[关键词] 荭草；肠外翻；吸收；UPLC-MS/MS；吸收速率常数

[收稿日期] 2014-01-04

[基金项目] 国家自然科学基金项目（81360664）； 贵州省中药现代化科技产业研究开发专项项目（黔科合中药字[2011]5081，黔科合重G字[2013] 4001）

[通信作者] 黄勇， 副教授， Tel： （0851） 6908899， E-mail：

[作者简介] 刘跃，硕士研究生， Tel：15085970554， E-mail：

荭草为蓼科植物荭草Polygonum orientale L. 的干燥全草，为贵州省地产药材，收载于《贵州省中药材质量标准》1988年版[1]，具有祛风利湿，活血，消积，止痛等功效，临床用于风湿性关节炎，冠心病，心胃气痛等[2]。课题组前期对荭草做了大量研究报道[3-5]，但其吸收机制及药效物质基础的研究还不够完善，基于“入血成分才可能是有效成分”的假说，本文采用大鼠肠囊外翻模型[6-7]，对荭草提取物透过肠壁的可被吸收成分进行分析，研究荭草提取物中各化学成分在不同肠段的吸收情况，有利于进一步明确其药效物质基础，并为荭草药物制剂剂型的研究提供理论依据与基础。

1 材料

1.1 仪器

Waters超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱联用仪（Acquity UPLC系统，MassLynx V4.1工作站，包括二元高压梯度泵、自动进样器、电喷雾电离源等）；Allegra64R低温高速离心机（美国Beckman Coulter公司）；MTN-2800D氮吹浓缩装置（奥特塞恩斯仪器公司）；超纯水机（四川沃特尔科技发展有限公司）；自制麦氏浴管；混合气体（95%O2，5%CO2）；DK-98-ⅡA恒温水裕锅（天津泰斯特仪器有限公司）。

1.2 试剂

葛根素（批号0752-9605）、原儿茶酸（批号809-200102）对照品购自中国食品药品检定研究院；异荭草素、荭草素、牡荆素、木犀草苷、槲皮苷、山柰素鼠李糖苷对照品自制（纯度≥98%）；荭草提取物（批号090618）；盐酸维拉帕米（阿拉丁）；甲醇（HPLC级，天津科密欧化学试剂有限公司）；乙腈（HPLC级，德国Merck 公司）；实验用水为超纯水；其余试剂均为分析纯。

Tyrode液：称取NaCl 8.0 g， KCl 0.2 g， CaCl2 0.2 g， NaHCO3 1.0 g， NaH2PO4 0.05 g， MgCl2 0.1 g， 葡萄糖 1.0 g，加蒸馏水溶解后与溶解的CaCl2及葡萄糖混匀，蒸馏水定容至1 L即得。

1.3 动物

健康SD大鼠，雄性，体重为（250±20） g，由贵阳医学院动物中心提供， 批号SCXK（黔）2002-0001。

2 方法与结果

2.1 分析条件

色谱条件如下。Waters BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；Waters Van Guard BEH C18保护柱（2.1 mm×5 mm，1.7 μm），流动相为0.1%甲酸乙腈（A）-0.1%甲酸水（B），梯度洗脱（0～0.5 min， 15% A； 0.5～0.8 min， 15%～ 20% A； 0.8～3 min， 20%～25% A； 3～4 min， 25%～90% A；4～5 min， 90%～15% A），流速0.30 mL・min-1，柱温45 ℃，进样体积为2 μL。

质谱条件：采用电喷雾电离源（ESI），毛细管电离电压3 kV，离子源温度120 ℃ ；喷雾气与反吹气为氮气，去溶剂气流速650 L・hr-1，扫描方式为多反应离子监测（MRM），用于定量分析的原儿茶酸，异荭草素，荭草素，牡荆素，木犀草苷，槲皮苷，山柰素鼠李糖苷及葛根素（内标）监测离子反应分别m/z 152.8/109.0；m/z 449.2/299.1；m/z 449.2/329.2；m/z 433.2/313.0；m/z 449.2/287.1；m/z 449.2/303.1；m/z 433.2/287.1；m/z 417.0/267.0。

2.2 标准溶液的配制

精密称取原儿茶酸，异荭草素、荭草素、牡荆素、木犀草苷、槲皮苷、山柰素-鼠李糖和葛根素适量，用甲醇配制成原儿茶酸（1.202 g・L-1）、 异荭草素（0.946 g・L-1）、荭草素（0.844 g・L-1）、牡荆素（0.816 g・L-1）、木犀草苷（0.856 g・L-1）、槲皮苷（1.200 g・L-1）和山柰素-鼠李糖苷（1.210 g・L-1）的储备液，置冰箱（-20 ℃）保存，备用。分别精密量取原儿茶酸等7种对照品储备液适量，48 ℃下氮气吹干，用空白Tyrode液溶解后按梯度稀释成所需浓度，得混合系列标准溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性试验 比较空Tyrode液、混合对照品溶液和荭草供试液的色谱行为，在建立的色谱条件下考察其专属性。原儿茶酸等7种成分及葛根素（内标）的保留时间（tR）分别为1.27，1.5，1.92，2.03，2.32，2.48，2.95，3.66 min，空白肠液无干扰，见图1。

2.3.2 线性关系的考察 取混合系列溶液各100 μL，按2.4项下操作，建立标准曲线。以待测物的峰面积与内标峰面积之比（A/Ai）为纵坐标Y，各物质浓度（C）为横坐标X进行直线回归，权重系数为1/X，计算标准曲线回归方程和相关系数。原儿茶酸（Y=0.136X+0.006 1，R2=0.999 4，0.049 5～36.06 mg・L-1），异荭草素（Y=0.172X+0.065 7，R2=0.994 5，0.415 2～302.7 mg・L-1），荭草素（Y=0.252X+0.106 4，R2=0.991 7，0.370 5～270.1 mg・L-1），牡荆素（Y=0.320X+0.028 4，R2=0.995 5，0.145 5～106.1 mg・L-1），木犀草苷（Y=0.480X+0.003 6，R2=0.999 6，0.058 7～42.80 mg・L-1），槲皮苷（Y=0.367X+0.013 3，R2=0.999 6，0.115 2～84.00 mg・L-1），山柰素鼠李糖苷（Y=0.510X-0.005 0，R2=0.999 5，0.016 6～12.10 mg・L-1）。

2.3.3 回收率试验 按2.3.2项下操作，分别配制高，中，低3个浓度的原儿茶酸等7种成分的溶液，每个浓度平行配制5份，将测得的原儿茶酸等7种成分的A/Ai代入标准曲线方程，以测得量与加入量之比计算方法回收率，结果在92.58%～104.9%，符合生物样品分析要求。

2.3.4 精密度试验 按2.3.2项下操作，分别配制高，中，低3个浓度的原儿茶酸等7种成分的溶液，每个浓度平行配制5份，算日内精密度，结果均≤13.58%；3种浓度连续测定5 d，计算日间精密度，结果在1.35%～12.65%，符合生物样品分析要求。

2.3.5 稳定性试验 按2.4项下方法处理肠吸收液样品，分别于0，2，4，6，8，12 h取样分析，原儿茶酸等7种成分的RSD均

2.4 大鼠肠外翻吸收模型实验方法[8]

临用前将荭草提取物用Tyrode液溶解，分别制成10 mL质量浓度分别为2.5，5.0，10.0 g・L-1的供试液，分别在15，20，45，60，90，120 min取样200 μL，同时补充等体积的37 ℃ Tyrode液，实验结束后将肠管纵向剖开，自然摊于滤纸上测量长度和宽度，记录吸收面积A。取供试品溶液100 μL，置1.5 mL塑料离心管中，加20 mg・L-1内标溶液20 μL，900 μL 15%乙腈（含0.1%的甲酸），涡混1 min，15 000 r・min-1离心5 min，取上清液进样UPLC-MS/MS分析，代入标准曲线计算浓度。

2.5 计算方法[9]

间点取样的实际检测浓度，V平衡为平衡前肠管中加入的台氏液体积，V取样为每次取样的体积。

吸收速率（Ka）药物的累积吸收量对时间作相关回归分析，得出的斜率（L） 除吸收表面积（A）求得吸收速率（Ka）。

2.6 肠外翻实验结果

2.6.1 荭草提取物中各成分吸收情况 制备十二指肠、空肠、回肠和结肠各肠段不同时间点荭草提取物外翻供试品溶液，计算各肠段中各成分的累积吸收量，绘制Q-t（本文以10.0 g・L-1的荭草提取物溶液中原儿茶酸、异荭草素在肠道不同部位Q-t为例绘图），并进行回归分析。结果表明荭草提取物中的原儿茶酸、异荭草素、荭草素、牡荆素、木犀草苷、槲皮苷及山柰素鼠李糖苷7个成分在不同浓度时均可进入肠囊，且浓度在检测的线性范围内，各成分的累计吸收量-时间曲线均为上升趋势，未呈现饱和趋势，说明7种成分在120 min内吸收未达到饱和状态。通过回归分析，结果表明不同浓度时各组分在不同肠段的吸收均为线性吸收，其回归相关系数（R2）均达到0.95以上，符合零级吸收速率[10]， 见图 2。

2.6.2 荭草提取物不同浓度时各成分的KA比较 参照文献[9]计算不同药物浓度荭草提取物中各成分的吸收速率常数（KA），见表 1，2。结果显示在各肠段中，随着药液质量浓度增加，各成分KA呈线性增加（R2>0.95），表明各成分以被动扩散机制吸收。而从统计结果可知肠囊对各成分的吸收具有浓度及肠段依赖性，结肠对原儿茶酸等成分的吸收较其余肠段慢，统计学有显著性差异（P结肠。可看出荭草提取物中不同成分在肠囊中的吸收具有较大差异，这可能是各成分不同的化学结构所致。

3 讨论

本实验采用外翻肠囊模型，建立了UPLC-MS/MS测定荭草外翻肠囊样品中7个有效成分含量，其方法快速、简便，能显著提高定量分析的重复性和可靠性以及定性分析的准确性[11]，可成功应用于荭草提取物中有效成分的肠道吸收动力学研究，为荭草药物制剂剂型的研究提供理论依据与基础。

实验还考察了P-gp抑制剂对吸收的影响，通过在供试药液中加入P-gp抑制剂维拉帕米（100 μmol・L-1），对Q和KA进行方差分析，结果显示原儿茶酸等各成分在不同肠段中均无显著性差异，表明荭草提取物中原儿茶酸等7种成分可能不是P-糖蛋白的底物。

本实验结果表明原儿茶酸、异荭草素、荭草素、牡荆素、木犀草苷、槲皮苷、山柰素鼠李糖苷均能较易透过肠黏膜；课题组前期对荭草的入血成分进行了相关研究[12]，研究结果表明口服荭草提取物后，能发现5种原型吸收入血的成分，其余成分未能检测到，可能与其在提取物中含量较低及检测灵敏度有关。2种手段研究荭草提取物吸收成分存在较好的对应关系，通过检测离体外翻肠囊实验大致推测能在体吸收入血的成分，实现快速寻找中药或中药复方药效物质基础之目的。

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Absorption of extractive Polygonum orientale in rat everted gut sacs

LIU Yue， TANG Li， CAO Xu， ZHENG Lin， WANG Ai-min， HUANG Yong

（1. Guizhou Provincial Key Laboratory of Pharmaceutics， School of Pharmacy， Guiyang Medical College， Guiyang 550004， China；

2. Engineering Research Center for the Development and Application of Ethnic Medicine and Traditional Chinese Medicine，

Ministry of Education， Guiyang Medical College， Guiyang 550004， China）

[Abstract] Using in vitro everted gut to investigate the intestinal absorption of the extracts from Polygonum orientale at different concentration. UPLC-MS/MS was used to detect the content of protocatechuic acid， isoorientin， orientin， vitexin， cynaroside， quercitrin， kaempferol-rhamnoside in different intestinal segments， then compared the results with the absorption of chemical components of extractive P. orientale in each intestinal segments， and calculated the absorption parameter. We took the statistic analysis with SPSS statistic software. The influence significance of each factors were analyzed to describe the character of absorption. The absorption of each component is linearity in different intestinal segments and different dose， and the square of coeficient correlation exceed 0.95， which consistent with zero order rate process. The KA increase along with the raised dosage of the extractive P. orientale（R2>0.95）， indicated it is the passive absorption； different intestinal segments have different absorption. And the absorption trend in intestinal is duodenum， jejunum， ileum are greater than the colon. As ingredients are selectively absorbed in intestinal sac， the everted intestinal sac method is selected to assess the intestinal absorption charcteristics of ingredients of extractive P. orientale.

[Key words] Polygonum orientale； in vitro everted intestinal sac； absorption； UPLC-MS/MS； absorption rate constant

doi：10.4268/cjcmm20141135