广西罗城仫佬族人群HIV-1感染相关基因CCR5多态性的初步研究

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摘要：目的：了解广西仫佬人群中HIV辅助受体CCR532和CCR5-894C缺失等位基因突变频率和多态性的特点，为评估该民族人群对HIV的遗传易感性和艾滋病的防治提供理论依据。方法：以197例仫佬族为研究对象，应用PCR和DNA测序等方法检测ccr532和CCR5-894C缺失突变体。结果：未发现CCR532和CCR5-894C缺失突变体。结论：由于未发现CCR532和CCR5-894C缺失突变体，推测仫佬族人群对HIV-1病毒感染可能具有较大的遗传易感性。

关键词：基因多态性；HIV-1；CCR5

中图分类号： Q754 文献标识码： A 文章编号： 1008-2409(2007)06-1176-03

A study on the Gene-Polymorphism CCR5 of HIV carriers in Mulao Nationality of Luocheng County,Guangxi Zhuang Autonomous Region/CHEN Sen-zhou，CHEN Zhe,FAN Xiao-hui, et al.∥Guilin Medical College,Guilin 541004,China

Abstract:Objective：To analyze the mutation frequency of Mulao receptors CCR532 and the CCR5-894C deletion allele and the features of polymorphism so as to provide scientific basis for the evaluation of the susceptibility of infection with HIV among the Mulao residents for the prevention and treatment of AIDS.Methods:Our analysis were based on 197 blood-samples of 197 Mulao subjects.The deletion mutant of CCR532 and CCR5-894C was analyzed by PCR and sequence method.Results:No mutant of deletion in CCR532 and CCR5-894C was found in the test of the 197 subjects.Conclusion:After series of tests, no deletion mutant was found in CCR532 and CCR5-894C.So we can make a conclusion that the people of Mulao in Guangxi Zhuang Autonomous Region face with great genetic susceptibility of infection with HIV-1.

Key words:Gene polymorphism； HIV； CCR5

人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）是一种感染人类免疫系统细胞的慢病毒，HIV的感染导致获得性免疫缺陷综合征(acquired immunode ficiency syndrome ,AIDS),简称艾滋病。艾滋病是一种全球性疾病，蔓延速度快、死亡率高，又无特效治疗方法。是危害人类健康和生命最严重的病毒性疾病之一。WHO 2006年的年度报告显示：自1981年以来因感染艾滋病而死亡的总人数达到2500万，艾滋病病毒感染者总人数已达3950万。中国自1985年发现第一例艾滋患者以来，现有艾滋病病毒感染者和患者约65万人，云南、河南、新疆、广西、广东的感染人数位居全国前列。CCR5是HIV-1的重要辅助受体，参与HIV-1与细胞膜的融合过程[１]。CCR5的基因多态性主要包括CCR532，CCR5m303，CCR5-894C缺失等，中国主要民族中CCR532基因突变频率比白种人要低得多，CCR5m303则完全检测不到[２-４]。Ansari-Lari等[５］报道CCR5基因多态性存在明显的人种差异，其中668位A-G和894位C缺失为中国人和日本人所特有，两者频率均为4％。笔者选择广西仫佬人群为研究对象，检测HIV辅助受体CCR532和CCR5-894C缺失等位基因突变频率，从而了解其多态性的特点，为卫生部门评估广西人群对HIV的遗传易感性和艾滋病的防治提供一定的依据。

1 对象与方法

1.1 对象

通过广西罗城县血防站采集197份仫佬族血样，年龄21～54岁，其中男性89名，女性108名（均得到知情者同意方取血样）。

1.2 方法

1．2．1 基因组DNA提取 TAKARA blood genome DNA extraction kit购自大连宝生物工程公司；Taq DNA合成酶，PCR Marker，CCR532，CCR5-894C缺失引物均购自上海生物工程公司。

根据试剂盒(TAKARA blood genome DNA extraction kit)介绍的方法提取全血基因组DNA：取混合均匀的100μl血液样品，加入含500μl的GenTLE Solution I的离心管中，立即震荡10 s左右，室温放置10min后，12000rpm，离心5 min，除去混合物，加入1 ml的GenTLE Solution Ⅱ，上下颠倒离心管数次，22℃12000rpm，离心2 min。除去上清后，加入500μl GenTLE Solution Ⅲ，轻微振荡10 s混合。同样条件离心5 min后，将上清移至另一个新的离心管中，加入500μl的异丙醇，上下颠倒直至看见白色丝状沉淀，4℃12000rpm，离心5 min后，除上清，加入1ml的70％ 乙醇洗涤沉淀，再次4℃12000 rpm，离心5 min，除去上清干燥，用40μl的TE缓冲液溶解沉淀，取2μl作为PCR反应模板，余下DNA样品存于-20℃保存备用。

1．2．2 PCR扩增基因组DNA PCR的反应体系组成:10×PCR反应缓冲5μl,Mg2+(20mM)3.8μl,dNTP(10mM)1μl，正向和反向引物分别为1μl,Taq DNA合成酶0.6U，人外周血基因组DNA模板2μl，加无菌ddH2O至50μl。

CCR532PCR反应条件为:变性94℃6 min；循环反应：94℃变性30 s，58℃退火30 s，70℃延伸1min，共进行30个循环；延伸70℃延伸10min。

CCR5-894C缺失反应条件为:94℃4min，94℃30 s，61℃30 s，72℃30 s，30个循环；72℃／10 min。PCR产物经Hind III37℃酶切2h。

取5μl反应产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯透射分析观察结果并拍照。根据PCR产物大小、数目和基因型之间的关系，判断扩增基因的基因型。

1．2．3 测序 DNA测序随机取3份PCR产物测序(大连宝生物工程公司)。

2 结果

2．1 CCR532突变与否的判定根据靶DNA的基因类型，推测PCR扩增的产物经过电泳分析后，可能产生3种结果，出现单纯242bp片段称之为野生型CCR5(wild type，Wt)，出现单纯210bp片段为突变纯合子型CCR5(mutant type，Mt)即CCR532Mt／Mt，出现242bp和210bp两种片段为突变杂合子型CCR5，即CCR5／CCR532 Wt／Mt。CCR532扩增分析结果检测197例个体中，未发现有CCR532等位基因突变，均为野生型CCR5(图1)。随机取3份血样PCR产物进行序列测序，得到的序列与报道的CCR5基因相比较，证明得到的242bp片段为野生型CCR5基因。图1 197份血样CCR532 PCR扩增结果（部分）

Lane 1:DNA markerLane 2-11：血样PCR扩增产物

2．2 CCR5-894C缺失野生型等位基因没有Hind III酶切位点，而894位C缺失的等位基因新形成了Hind III酶切位点。所以纯合野生型电泳为322bp一条带，纯合突变型电泳为301bp一条带(切下的21bp条带电泳不可见)，杂合型电泳为322bp和301bp两条带。CCR5-894C缺失扩增分析结果检测197例个体中，未发现有CCR5-894C缺失等位基因突变，均为野生型CCR5(图2)。3份PCR产物测序得到的序列与报道的CCR5基因相比较，得到的322bp片段为野生型CCR5基因。图2 197份血样CCR5-894C缺失PCR扩增结果（部分）

Lane 1:DNA markerLane 2-11：血样PCR扩增产物

3 讨论

CCR532突变使辅助受体CCR5在细胞膜的表面产生截短的、无功能的穿膜蛋白质，进而HIV-1gp120不能与CCR532有效地结合，使HIV-1病毒不能进入宿主细胞。CCR532突变纯合子个体对嗜单核-巨噬细胞性HIV-1感染有完全保护作用，突变杂合体则有部分保护，可显著延长发病期[６-８]。而CCR5-894C缺失突变使辅助受体CCR5在细胞表面表达下降或消失，对HIV-1感染和艾滋病病程的影响未见报道[９]。

广西壮族自治区是一个多民族的聚集地，而仫佬族是广西世居民族，主要聚居在罗城仫佬族自治县，在广西本土少数民族中具有一定的代表性。笔者初步检测了仫佬族人群hiv-1趋化受体CCR532和CCR5-894C缺失基因突变频率，结果未检测到CCR532和CCR5-894C缺失等位基因突变，推测广西仫佬族人群对HIV-1病毒感染可能具有较大的遗传易感性。广西近年HIV感染人数不断上升，加强HIV预防和监控刻不容缓。

参考文献：

［1］ SIGNORET N，PELCHEN-MATTHEWS A，MACK M，et al．Endocytosis and recycling of the HIV coreceptor CCR5［J］．J Cell Biol，2000，151(6)：1281-1294.

［2］ 王福生，WANG JM．中国普通人群中感染HIV-1感染辅助受体和配体基因多态性的分析［J］．科学通报，2001，46（7）：569-573.

［3］ WANG FS，JIN L，LEI ZY，et al．Genotypes and polymorphisms of mutant CCR5Δ32, CCR2-64I and SDF1-3′A HIV-1 resistance alleles in indigenous Han Chinese［Ｊ］．Chin Med J,2001, 14(11):1162-1166.

［4］ 刘明旭，王福生，金磊，等．新疆维吾尔族人群中CCR5A32、CCR2-64I和SDF1-3 A等位基因多态性分布和意义［Ｊ］．中国性病艾滋病防治，2000，6(6)：324-326．

［5］ ANSARI-LARI MA，LIU XM，MICHAEL L，et al．The extent of genetic variation in the CCR5 gene［J］．Nat Genet，1997，16(3)：221-222．

［6］ SAMSON M，LIBERT F，DORANZ B，et al．Resistance to HIV-l infection in Caucasian individuals bearing mutant alleles of the CCR5 chemokine receptor gene［J］．Nature，1996，382(6592)：722-725．

［7］ GUIGNARD F，COMBADIERE C，TIFFANY HL，et al．Gene organization and promoter function for CC chemokine receptor 5 (CCR5)［Ｊ］．Immunology，1998，160(2)：985-992．

［8］ VOEVODIN A，SAMILCHUK E，DASHTI S．Frequencies of SDF-1chemokine，CCR5，and CCR2 chemokine receptor gene alleles conferring resistance to human immunodeficiency virus type 1 and AIDS in Kuwaits［J］．Med Virol，1999，58(1)：54-58．

［9］ BLANPAIN C，LEE B，TACKOEN M，et al．Multiple nonfunctional alleles of CCR5 are frequent in various human populations［J］．Blood，2000，96(5)：1638-1645.

(收稿日期： 2007-07-10)

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