六味地黄丸对阿尔茨海默病细胞凋亡的影响

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阿尔茨海默病（AD）是一种多病因神经变性疾病， 临床主要表现为近期记忆功能障碍， 随后为持续性学习能力减退， 判断推理丧失、失语、运动障碍等[1]。目前该病的发病率随年龄增长而增加， 有资料表明5%～15%的老年人有不同程度的痴呆症状， 严重者给家庭和社会带来很大负担。其病因及发病机理尚不十分清楚， 常于老年期或者老年前期发病， 发病缓慢， 呈进行性发展。预计2025年后全球将有2200万人患上AD， 到2050年患此疾病的人数将达4 500万[2， 3]。因此， 防治AD疾病将成为当今老年疾病研究领域的最重要前沿课题之一， 本研究通过观察六味地黄丸对AD大鼠模型海马相关指标的影响， 探讨六味地黄丸对大脑组织中细胞凋亡的抑制作用， 旨在为中医药治疗AD提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1. 1 材料 雄性Wista大鼠， 体重（200±20）g， 购自北京维通利华公司。所有大鼠饲养于SPF动物房中饲养， 实验室温度22～25℃。明暗周期12 h/12 h。所有大鼠适应性喂养3 d后， 按照体重随机分为三组：正常组、模型组和给药组。每组8只。

1. 2 药品及试剂 六味地黄丸浓缩丸（北京同仁堂公司）；β淀粉样蛋白（Aβ25-35 Sigma公司）；脑立体定向仪（徽淮北正华生物仪器设备有限公司生产）；Y型电迷宫（中国药物研究所）；微量注射器（Hamilton公司）；BCl-2抗体， Caspase-3抗体。

1. 3 造模方法 将Aβ用无菌生理盐水事先稀释成10 g/L， 震荡混匀， 充分溶解， 密封， 在37℃温箱孵育72 h后变成为凝聚态， 放入4℃冰箱保存备用。造模当日大鼠经10%水合氯醛麻醉（0.35 ml/100 g）， 固定于脑立体定位仪上， 常规消毒皮肤， 参照大鼠脑立体定位图谱， 以前囟为基准点， 于前囟后30 mm， 中线右侧旁开2.5 mm， 为穿刺点， 用牙科钻钻开颅骨， 以微量注射器自脑表面垂直进针2.5 mm， 将孵育好的溶液分别缓慢注入双侧海马组织以至完全吸收， 退针缝合伤口。正常组大鼠仅注射相同剂量的生理盐水。给药组大鼠于造模结束次日开始， 每天给予六味地黄丸水溶液2 ml灌胃， 而正常组和模型组及给予相同剂量的生理盐水， 连续灌胃30 d后， 处死所有大鼠。

1. 4 Y型迷宫实验 给药第20天， 进行大鼠迷宫实验。先将大鼠放入Y型电迷宫中适应3～5 min， 实验时以无规则次序变换安全区， 大鼠受电击逃到安全区后， 灯光刺激持续10～15 s， 熄灯后即完成1次测试， 休息30 s， 然后再以大鼠所在支臂作为下1次测试起点， 开始第2次测试， 依次重复。训练20次/d， 连续训练3 d。大鼠在足底通电后10 s内1次性跑向安全区为正确反应， 否则为错误反应。在连续10次电击中， 9次为正确反应（即9/10）则达到学会标准。

1. 5 Western检测 大鼠处死后， 剥取海马组织， 充分剪碎加入RIPA裂解液， 组织匀浆器匀浆， 12 000 rpm， 4℃离心15 min， 静置取上清备用。采用BCA法对蛋白浓度进行定量。将蛋白加入5xloading buffer后煮沸变性5 min。15% SDS聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳转移至PVDF膜上， 5%脱脂牛奶室温封闭2 h， 滴加一抗Bcl-2（1：500）和Caspase-3（1：500）， 4℃孵育过夜， HRP标记的羊抗兔二抗（1：10000）室温孵育30 min后， 采用ECL化学发光曝光采集图像， 以β-actin作为内参照， 对蛋白表达量进行定量分析。

1. 6 观察指标 行为正确率（正确反应数占总测试数的百分比）、尝试次数（指动物达到学会标准所需要的次数， 训练20次后仍未达到学会标准则记录为20次）[3]。

1. 7 统计学方法 采用SPSS18.0统计学软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示， 采用t检验；计数资料采用χ2检验。P

2 结果

2. 1 与正常组比较， 模型组的尝试次数显著增加而行为正确率则显著降低， 差异具有统计学意义（尝试次数P

2. 2 与正常组比较， 模型组Caspase-3的蛋白表达出现明显升高（P

3 讨论

AD是以渐进性的认知功能障碍为核心症状的神经变性疾病， 目前认为其在发展中的神经元死亡过程主要是凋亡。细胞凋亡的发生机制非常复杂， 受多种凋亡促进或抑制因素的影响[4]。Caspase是细胞凋亡过程中最重要的蛋白酶， 凋亡的最后实施是通过Caspase的激活而实现的， 而Caspase-3是Caspases级联反应中下行最关键的凋亡执行蛋白酶。在蛋白酶级联切割过程中， Caspase-3处于核心位置， 不同的蛋白酶分别切割Caspase-3酶原， 从而激活Caspase-3， 活化的Caspase-3又进一步切割不同的底物， 导致蛋白酶级联切割放大， 最终使细胞走向死亡， 而后两者则是凋亡过程中至关重要的因子[5]。早在上世纪90年代， 就已经有学者开始研究凋亡与AD的关系， 而且越来越多的研究表明， 异常的凋亡可能在AD的发生过程中起到非常重要的作用[6]。

六味地黄丸是传统滋补肾阴的经典名方， 由熟地黄、山茱萸、山药、泽泻、牡丹皮、茯苓按8：4：4：3：3：3比例配伍而成。传统中医学认为肾与脑息息相关， 肾主骨生髓， 脑为髓之海。已有研究表明， 其可调节内分泌失调、增强机体免疫力， 又能改善体内自由基代谢和大脑功能， 使人体各组织器官处于正常状态协调运行[7]。研究发现用该方煎剂灌胃， 使老年阴虚模型大鼠的Morris迷宫逃避潜伏期、长时程突触增强， 潜伏期缩短和群峰电位均增强， 并通过保护脑内胆碱能神经系统或纠正快速老化模型小鼠海马基因的异常表达来达到改善模型动物学习记忆和认知障碍[8]。但是目前对六味地黄丸干预细胞凋亡的相关机制尚不清楚可能与其抑制氧化应激有关[9]， 但也可能存在对凋亡调节基因直接的调控作用， 关于病的详细发病及预防机制尚需进一步的实验证实。

参考文献

[1] 林杭， 吴渝宪， 王伟文， 等. Tau蛋白调控Fyn信号通路在阿尔茨海默病大鼠发病机制中的作用.中国老年学杂志， 2013， 33（17）： 4171-4173.

[2] 王虎平， 吴红彦.逍遥散及其配伍组方对阿尔茨海默病小鼠学习记忆的影响.中国老年学杂志， 2013， 33（18）：4459-4461.

[3] 李高申， 刘建涛， 赵唯贤， 等.逍遥散对大鼠阿尔茨海默病模型前额叶皮质PP-2A和GSK-3β的影响.中国实验方剂学杂志， 2013， 19（17）：244-247.

[4] 李鸿文， 门楠， 蒋常文， 等.反式转录激活因子-X连锁凋亡抵制蛋白融合蛋白对阿尔茨海默病模型大鼠Caspase-3表达与活性的抑制.解剖学杂志， 2013， 36（3）：357-360.

[5] 何明大， 刘运林.脑灵汤对阿尔茨海默病模型鼠凋亡调控基因的影响.中国现代医学杂志， 2005， 15（22）：3398-3401.

[6] 王晓映， 刘鹏， 朱华， 等.阿尔茨海默病模型小鼠凋亡相关蛋白的表达.中国老年学杂志， 2014， 32（7）：1446-1447.

[7] 王红梅， 宋彩梅， 刘新民， 等.六味地黄丸对肾虚型老年痴呆动物模型的改善作用. 中国实验方剂学杂志， 2012， 18（5）：112-116.

[8] 陈乔， 李征峰， 李青， 等.六味地黄丸对老年大鼠学习记忆及脑内M1胆碱受体阳性神经元的影响.中国实验方剂学杂志， 2013， 19（3）：205-208.

[9] 罗红波， 杨期东， 杨金升， 等.β淀粉样蛋白诱发的内质网应激及特异性凋亡因子的影响.中华老年医学杂志， 2009， 28（12）： 1016-1019.

[收稿日期：2014-09-09]