灯盏花素在丙醇-硫酸铵双水相体系中的分配行为研究
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摘要: 研究了灯盏花素在丙醇-硫酸铵双水相体系中的分配行为，重点对双水相的形成、硫酸铵用量和初始pH值对分配比的影响进行了研究.在盐水相、丙醇初始体积分别为10.0 mL和4.0 mL，硫酸铵用量为3.5 g，初始pH为4.08条件下，灯盏花素的最大分配比达107.5，相应的萃取率达97.7%.在实验基础上建立了相应的“二元弱酸”分配模型.
关键词: 灯盏花素；丙醇-硫酸铵双水相；分配比
中图分类号:O657.7 文献标识码:A 文章编号:1672-8513(2010)02-0106-04
Study on the Partition Characteristics of Breviscapinum in the Propyl-Alcohol Ammonium Sulfate Aqueous Two-phase System
[KH*2]GAO Yuntao,DAI Yun，LI Shiyue，YANG Yaohong
（School of Chemistry and Biotechnology，Yunnan University of Nationalities，Kunming 650031，China）
Abstract: Partition characteristics of breviscapinum in the propyl-alcohol ammonium sulfate aqueous two-phase system were studied. The formation of aqueous two-phase was investigated and the effects of the amount of (NH4)2SO4 and initial pH of the solution on the partition ratio were measured. The experiment showed that optimum partition initial conditions were 10.0 mL，salt-water volume and 4.0 mL propyl-alcohol volume, 3.5g (NH4)2SO4 and pH 4.08, with the maximum partition ratio as 107.5 and the maximum extraction rate as 97.7%. A “weak diacid partition model” was developed based on the experiment.
Key words: breviscapinum；propyl-alcohol ammonium sulfate aqueous two-phase；partition ratio
0 引言
民族药现代化是弘扬祖国传统医药的重要课题.研究民族药有效成分的高效提取、分离技术及相关理论是推进民族药现代化的重要环节.自20世纪60年代以来，双水相分配(ATPP)技术［1-2］被广泛用于生物工程、制药、食品化工、金属离子的分离等领域.近年来报道了一种水溶性低级醇-盐双水相体系［3-4］，该法克服了传统的聚合物-盐双水相体系中因使用粘度较大的聚合物成本高、回收困难、不易后续处理等缺点，具有操作简便，条件温和的优点，已应用于药用植物有效成分提取分离［5-9］.
灯盏花又名灯盏细辛［7］，是菊科植物短葶飞蓬的干燥全草，属云南苗族药，被列为国家重点发展的中草药品种和中医治疗心脑血管疾病临床必备急救药品，但对灯盏花主要药用活性成分灯盏花素的提取分离方法研究并不多.本文研究了灯盏花素在丙醇-硫酸铵双水相体系中的分配行为，并提出了“二元弱酸”分配模型，对分配机理进行了探讨，结果表明，灯盏花素在丙醇-硫酸铵双水相体系中可获得较高的分配比和萃取率，是萃取分离灯盏花素较理想的方法.
1 实验材料与方法
1.1 材料、试剂与仪器
灯盏花素（含量＞98.0 %，昆明龙津药业有限公司提供）；灯盏花素溶液：0.5 mg•mL -1；灯盏花（购自当地中药店，产自云南玉溪）；灯盏花乙素对照品(中国药品生物品检定所，批号:0842-200102,纯度98.0 %)；无水乙醇；正丙醇；石油醚；硫酸铵.
所用试剂均为分析纯，实验用水为离子交换纯水.
AS3120A超声波清洗器，9200型紫外分光光度计（北京瑞利分析仪器公司），旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）.
1.2 方法
1.2.1 低级醇-盐双水相体系
低级醇-盐双水相水体系见文献［3-4］，其中水溶性有机溶剂选择丙醇，成相盐选择硫酸铵，通过改变丙醇与水的比例和盐的用量可以控制双水相体系的形成.本文选择的双水相体系丙醇初始体积为4.0 mL，水初始体积10.0 mL，硫酸铵用量为3.5 g.
1.2.2 分配行为研究方法
分别取一定量硫酸铵，10.0 mL水，0.2 mL、0.5 mg•mL -1灯盏花素溶液于分液漏斗中，用0.1 mol•L -1盐酸调节溶液的pH值，静置5 min，加入一定量丙醇，振摇萃取，静置5 min，待两相完全分层之后取出富醇上相，分别测定上下相的体积，测定富醇上相和盐水下相中灯盏花素的浓度，计算分配比D和萃取率E，分相后富醇上相的体积Vend与丙醇初始体积Vin的比值Rv.
1.2.3 测定方法
灯盏花素测定方法采用分光光度法［10］，以灯盏花乙素为标准.
2 结果与讨论
2.1 丙醇-硫酸铵双水相体系的形成
丙醇能与水完全互溶，在丙醇-水体系中加入无机盐，由于盐析作用，形成富醇上相和盐水下相2相，我们曾对丙醇-盐体系的分相行为进行过研究，本文将通过研究盐对富醇上相的体积及组成变化的影响，重点讨论这种变化对灯盏花素分配行为的影响.
富醇上相的体积变化可用分相后富醇相的体积Vend与丙醇初始体积Vin的比值Rv描述，不同丙醇初始体积硫酸铵加入量ws对Rv的影响实验结果见图1.
从图1可知，当双水刚好形成时，Rv=Vend/Vin1，这说明丙醇逐渐从盐水相中析出，Rv>1说明双水相形成过程中有部分水进入了富醇上相，继续加入硫酸铵，Rv 开始下降，这说明进入富醇上相的水从富醇上相中逐渐分离出来，富醇上相中丙醇浓度不断增加，当Rv趋近1，并恒定不变时，可认为丙醇与水已完全分离，此时的上相几乎由丙醇组成，而下相则由盐水溶液组成.
双水相的形成是硫酸铵与丙醇争夺水分子的过程，随着硫酸铵用量，盐对水的束缚能力增强，这样丙醇从盐水相中析出，而水分子也离开富丙醇上相，其结果是硫酸铵的加入影响了富丙醇上相的组成，硫酸铵用量越大，富丙醇上相中丙醇的相对浓度越高，盐水下相中丙醇的相对浓度则降低，硫酸铵用量对富醇上相的组成有重要的影响，硫酸铵用量增加，富醇上相中丙醇浓度也随之增加.
从图1也可知，Vin越大，Rv达到最大及Rv趋于1所需的硫酸铵用量也越小，即富醇上相中丙醇达到相同浓度所需的硫酸铵用量也越小.
2.2 硫酸铵用量对分配比的影响
固定盐水相初始体积为10.0 mL，盐水相初始pH为4.08，在不同丙醇初始体积Vin条件下，研究硫酸铵用量对灯盏花素分配比的影响，结果见图2，随着硫酸铵用量增加，灯盏花素在丙醇-硫酸铵双水相体系中的分配比随之增加，但当硫酸铵用量达到一定程度时，分配比则开始下降.
对于不同丙醇初始体积，丙醇初始体积越大，达到最大分配比所需的硫酸铵用量越少，当丙醇初始体积分别为3.0,40,500 mL时，最大分配比所需的硫酸铵用量分别为40,35,30 g.
根据2.1的研究结果，在丙醇-硫酸铵双水相中，上相由混有少量水的丙醇构成，下相由硫酸铵水溶液的水及少量丙醇构成，硫酸铵的加入影响了富丙醇上相的组成，硫酸铵用量越大，富醇上相中丙醇浓度越高，其极性自然越低.灯盏花素是弱极性的物质，图2中分配比最高点富醇上相同样极性较弱，适合于灯盏花素分配.
2.3 pH对分配比的影响
固定盐水相初始体积为10.0 mL，丙醇初始体积为4.0 mL，硫酸铵用量为3.5 g，研究盐水相初始pH对灯盏花素分配比的影响，结果见图3，在pH 5～10范围内，随着pH增加，尽管在pH 6.5处有一很小峰，灯盏花素分配比基本上呈下降趋势，但在pH 5～7范围内变化较小，而pH 7～10范围内变化较大.在pH 3～5范围内，pH对灯盏花分配比的影响较大，曲线呈鞍形，在pH=4.08处灯盏花分配比有一个最大值，当pH＞4.08，或pH＜4.08时，灯盏花分配比则明显下降.
灯盏花素是黄酮类化合物，分子中多具有多个酚羟基，pH较高氢离子会被电离，形成极性较大的阴离子，pH较低呈分子形态，但过低pH，灯盏花素上的羰基会质子化，形成极性较大阳离子.萃取分离过程是灯盏花素在两相中的分配过程，极性小的分子形态在富醇上相中分配比更大，而极性较大的离子形态在富醇上相中分配比则相对较小，由此不难解释图3初始pH对分配比的影响，在较高和较低pH时，灯盏花素以离子形态为主，分配比较低，而在pH=4.08附近，灯盏花素以分子形态为主，分配比相对较高.
在盐水相、丙醇初始体积分别为10.0 mL和4.0 mL，硫酸铵用量为3.5 g，初始pH为4.08条件下，灯盏花素在丙醇-硫酸铵双水相体系中的最大分配比达107.5，相应的萃取率达97.7%.
2.4 分配机理
灯盏花素主要成分为灯盏花乙素（见图4），有3个酚羟基和2个羰基，pH较高酚羟基失去氢成为极性较大的阴离子，pH较低则以弱极的分子形态存在，但如果pH过低，羰基会质子化成为极性较大阳离子.从酸碱平衡角度看，灯盏花乙素相当于多元弱酸.由于3个酚羟基因位置不同酸性差异较大，可忽略酸性较弱的酚羟基的离解，将其近似为二元弱酸：
H2A +-H +Ka1HAKa2A+H
式中， H2A +、HA和A -分别是灯盏花乙素的羰基质子化阳离子形态、分子形态和酚羟基失质子的阴离子形态，Ka1、Ka2是相应的酸碱离解常数.根据物料平衡原理，：H2A +、HA和A -3种形态之间存在如下关系：
c0=［ H2A +］+［HA］+［ A -］
式中，c0是灯盏花乙素的分析浓度，［ H2A +］、［HA］和［ A -］分别是3种形态的平衡浓度.
丙醇-硫酸铵双水相体系由极性较小的富醇上相和极性较大的盐水下相组成，根据相似相溶原理，弱极性的HA将分配于富醇上相，极性较大的H2A +、和A -不利于在富丙醇上相中的分配，将分配于盐水下相，因此，HA是最主要的可萃取形态.
忽略H2A +和A -的萃取，萃取反应如下：
HAw+PrOHoKHA•PrOH（1）
K=［HA•PrOH］o[]［HA］w［PrOH］o（2）
式中，K是萃取的平衡常数，PrOH是丙醇，HA•PrOH是萃合物，角标“w”和“o”分别表示盐水下相和富丙醇上相，［HA］w是HA在盐水相中的浓度，［PrOH］o和［HA•PrOH］o分别是丙醇和萃合物在富丙醇上相的平衡浓度.［HA•PrOH］o是HA在富丙醇上相的唯一形态，因此HA在富丙醇上相的分析浓度c0′=［HA•PrOH］o .
用分布分数法进行处理：
［HA］=c0δHA=c0［H +］Ka1[]［H +］ 2+［H +］Ka1+Ka1Ka2（3）
K=c0′[]c0δHA［PrOH］o=D[]δHA［PrOH］o（4）
所以
D=KδHA［PrOH］o（5）
lg D=lg K+lg δHA+lg ［PrOH］o（6）
式6中，δHA是［HA］的分布分数，当pH固定时，分配比取决于［PrOH］o，根据2.1的研究结果，［PrOH］o 受(NH4)2SO4用量wsalt和丙醇初始体积Vin支配，wsalt和Vin越大，［PrOH］o越高，分配比越大，这与实验结果（图1、图2）完全一致.
当wsalt和Vin固定时，［PrOH］o也固定，分配比取决于分布分数δHA，δHA受［H +］或pH所决定，酸碱平衡理论可知，δHA与pH的关系是鞍形，因此，分配比与pH关系也是鞍形，这与实验结果（见图3）相近.因此，本文提取的二元弱酸分配模型较好地与实验研究结果相符，说明该模型是合理的.
对于式6中的K项，取决于双水相体系与被萃分子间的相互作用，包括静电作用、与分子构型有关的空间作用、疏水作用、亲和作用等.对本文的体系，可以不考虑静电作用和空间作用.疏水作用指极性低疏水的富醇上相基于相似相溶原则萃取同样极性低的疏水分子，这种疏水作用受到了富丙醇上相的组成和灯盏花素的存在形态所支配.在本文的体系中亲和作用为灯盏花素酚羟基和羰基与丙醇羟基之间的氢键，这种亲和作用是灯盏花素在具有较高分配比的重要原因.
因此，丙醇-硫酸铵-碘化钾双水相体系萃取灯盏花，萃取的平衡常数可用下式计算：
ln K=ln Kh+ln Kb+ln Km（7）
式中， Kh疏水性作用，影响因素是(NH4)2SO4用量和丙醇初始体积、pH；Kb是分离物质与体系相互间的氢键的贡献.Km其它因素如盐效应等的贡献.
3 结论
根据分配行为实验研究结果，本文提出灯盏花素“二元弱酸”分配模型，说明灯盏花素在丙醇-硫酸铵双水相体系之间存在较强的亲和作用与疏水作用，亲和作用指灯盏花素酚羟基和羰基与丙醇之间的氢键作用，疏水作用指富丙醇上相与分子态灯盏花素同为弱极性，有利于灯盏花素的分配，灯盏花素通过与双水相体系之间的亲和作用与疏水作用获得较高的分配比和萃取率.硫酸铵的用量和溶液的初始pH分别对富丙醇上相的组成和灯盏花素形态产生影响，从而对灯盏花素在富丙醇上相中的分配行为产生支配作用.可以预期，丙醇-硫酸铵双水相体系与带有酚羟基和羰基的其它黄酮类化合物同样具有较强的亲和作用和疏水作用，同样可获得较高分配比，该法是萃取分离黄酮类化合物较理想的方法，实现萃取分离的关键因素是盐的用量与溶液初始pH.
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收稿日期:2009-11-13.
基金项目:云南省社会发展科技计划项目（2007B148M）;云南省教育厅科学研究基金（06Y195C）;国家民委-教育部共建民族药资源化学重点实验室开放基金（MJY07010）.
作者简介:高云涛（1962-），男，博士，教授.主要研究方向：分析化学.