骨保护素在犬恒牙胚发育中的表达及意义

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[摘要]目的：探讨犬乳恒牙替换过程中骨保护素在犬恒牙胚发育中的表达及意义。方法：分别对乳牙期、替牙期、恒牙期本地犬取牙胚及其周围组织,制备石蜡切片,进行HE染色和牙胚内OPG的免疫组化染色,用彩色病理图像分析系统分析各组染色强度灰度值。结果：乳牙期、替牙期犬牙胚的成牙本质细胞OPG的免疫组化强度明显高于另外一组,成釉细胞中也有阳性信号。结论：OPG可能参与恒牙胚的形成和发育。

[关键词]犬恒牙胚；骨保护素；成牙本质细胞；成釉细胞

[中图分类号]R781 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2008）06-0877-2

The expression and significance of osteoprotegerin in the the development of of dogs' permanent teeth germs

CHEN Li-ping1，WU Wei1，BAI Hui-ying1，YANG Fu-sheng2

(1.Department of Dentistry, Qinghai Provincial Corps Hospital,Chinese Pepole′s Armed Police Force, Xi′ning 810001,Qinghai,China;2.College of Stomatology,Fourth Military Medical University)

Abstract:ObjectiveTo study the expression and significance of osteoprotegerin（OPG）in the development of dogs'permanent teeth germs. MethodsDogs of different ages were selected as objects,selected permanent teeth germs and their peripheral tissue of dogs in different periods of primary dentition roots stability，primary dentition roots resorption,permanent dentition,preparating of paraffin slice.HE dyeing and OPG immunohistochemical dyeing were analysing the gray value of dyeing tense.ResultsOPG dyeing tense of immunohistochemic in odontoblasts of the germs in period of primary dentition roots stability and primary dentition roots resorption is stronger than the other team.OPG position signals were observed on ameloblasts. ConclusionOPG probably takes partin the formation and development of dogs'permanent teeth germs.

Key words:dogs'permanent teeth germs;osteoprotegerin(OPG);odontoblasts;ameloblasts

骨保护素(osteoprotegerin，OPG)是肿瘤坏死因子受体超家族成员，其主要生物学作用是抑制破骨细胞(osteoclast,OC)形成、分化和增加骨密度，是抑制骨吸收的关键因子。有研究表明， OPG基因表达在牙滤泡，在牙齿萌出中发挥一定作用。而在恒牙胚发育中的作用却未见相关报道。本实验主要通过对犬恒牙胚成牙本质细胞中OPG的表达进行研究,探讨OPG在此过程中的作用。

1材料和方法

1.1材料及分组：动物选用本地犬共3只，分为3组，A组：乳牙牙根稳定犬(8周龄)；B组：乳牙牙根吸收犬(18周龄)；C组：成年恒牙列犬(22周龄)。

1.2试剂：兔抗人OPG多克隆抗体(北京博奥森生物工程有限公司)；SABC免疫组化检测试剂盒(北京博奥森生物工程有限公司)；DAB显色试剂盒(北京博奥森生物工程有限公司)。

1.3切片标本制作及观察：分别将实验犬以速眠新Ⅱ注射液按0.2ml/kg肌注麻醉，解剖分离双侧颈动脉后断头处死，颈动脉插管，用生理盐水冲洗,4%甲醛固定液进行灌注组织内固定，分离上、下颌骨，4%甲醛固定液外固定24h，上、下颌骨于甲酸、甲酸钠脱钙液中4℃脱钙，4周后分切成小块，再脱钙4周。脱钙后，分切、修整、酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡、石蜡包埋，制作5μm厚石蜡切片。石蜡切片脱蜡至水，常规HE染色，每只犬取5张切片共30张，每张切片光学显微镜下观察根尖组织。

1.4免疫组化染色及图像分析：切片脱蜡至水，一抗为兔源性抗体，稀释度1:350，其余步骤按试剂盒进行。用HPIAS-1000高清晰度彩色病理图像分析系统分析染色强度的灰度值，每个时期10张切片，每张切片随机选取4个成牙本质细胞进行测量。

2结果

A组：8周犬乳牙根未发生生理性根吸收，恒牙胚牙冠发育处于牙体组织形成期，牙本质、牙釉质基质开始形成。成釉细胞、成牙本质细胞高柱状，胞核椭圆形，远离基底膜，整齐排列，极性倒置明显。此时可见恒牙胚内成牙本质细胞及成釉细胞染色阳性，染棕黄色。空白对照组染色阴性。B组：18周犬乳牙根发生生理性吸收,恒牙胚冠部牙本质、牙釉质进一步形成和矿化，成釉器萎缩、上皮根鞘向根方生长，形成上皮隔，并可见上皮根鞘发生断裂。此时恒牙胚内成牙本质细胞及成釉细胞染色阳性（如图1），空白对照组染色阴性。C组：22周成年犬恒牙列，乳牙已脱落,恒牙萌出。恒牙成牙本质细胞染色阴性。经彩色病理图像分析系统分析，成牙本质细胞染色灰度值分析见表1。

经LSD检验，成牙本质细胞A、B组与C组间P＜0.05，即免疫组化染色强度A、B组与C组间有显著性差异，说明成牙本质细胞表达OPG的强度不同。成牙本质细胞、成釉细胞A组与B组间P＞0.05，即这两类细胞免疫组化染色强度A组与B组间无显著性差异。

3讨论

OPG是Simonet等[1]1997年在胎鼠小肠 cDNA文库中克隆出的一种新型分泌型糖蛋白，是缺乏跨膜结构域的肿瘤坏死因子受体超家族成员，具有降低OC分化和增加骨密度的功能。人类OPG基因定位于染色体8q23-24，包含5个外显子，在体内以单体和同源二聚体两种形式存在。OPG mRNA具有广泛的组织分布，在骨骼，OPG主要由成骨细胞和骨髓基质细胞产生。而骨的形态结构是通过不断的吸收与形成来维持的，骨的形成主要由成骨细胞负责，在骨量维持中起重要作用。研究发现过量表达 OPG的OPG转基因(opg+/+)小鼠表现为骨质硬化症，骨质坚硬，骨髓腔缩小，呈现明显的大理石样变，而 OPG基因敲除(opg-/-)小鼠在成熟前即显示严重的骨质疏松[2]。因此我们推测，OPG与牙齿硬组织矿化也可能存在一定的关系。

Yao S[3]发现在大鼠牙囊中有OPG的存在。金星爱等[4]研究发现，在牙齿萌出的骨内阶段中期牙囊成纤维细胞、成釉细胞OPGmRNA呈强阳性表达。当成釉细胞成熟后，对牙发生诱导作用，分化为成牙本质细胞，成熟后的成牙本质细胞已具备合成蛋白质的功能。本实验也发现：OPG的阳性信号出现于发育中的恒牙胚成牙本质细胞、成釉细胞中，镜下观察，两类细胞高柱状，细胞核大、椭圆形，远离基底膜，这种细胞形态学特点反映其功能和状态正处于活跃的基质分泌期；恒牙萌出后，其成牙本质细胞成为扁平状，说明其功能处于静止，染色结果为阴性。图像分析的结果两类细胞A、B两组间灰度值稍有不同，但相差不显著，提示牙胚发育期间，细胞的功能状态可能差别不明显，但成牙本质细胞A、B组与C组则有显著性差异，说明恒牙萌出后，成牙本质细胞OPG染色强度明显减弱，提示OPG可能参与了牙胚的形成和发育，推测可能与硬组织矿化有关。

[参考文献]

[1]Simonet WS,Lacey DL,Dunstan CR,et a1.Osteoprotegerin:A novel secretedprotein involved in the regulation of bone density[J].Cell,1997,89:309-319.

[2]YAO S,RING S,HENK WG,et a1.In vivo expression of RANKL in the rat dental follicle as determined by laser capture microdissection[J].Arch Oral Biol,2004,49(6):451-456.

[3]Bucay N,Sarosi I,Dunstan CR,et a1.Osteoprotegedn deficient mice develop early onset osteoporosis and arterial calcification[J].Genes Dev,1998,12(9):1260-1268.

[4]金星爱.RANKL在犬乳恒牙替换期牙龈上皮中的表达[J].哈尔滨医科大学学报,2007,41(4):333-337.

[收稿日期]2008-03-30[修回日期]2008-04-21