天门冬组织培养条件的优化

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摘要：以天门冬（Asparagus cochinchinensis）幼嫩茎段为外植体，考察1 g/L HgCl2灭菌时间对外植体的消毒效果，以及激素浓度组合对外植体愈伤组织、不定芽的诱导和不定芽生根的影响。结果表明，1 g/L HgCl2处理7 min，外植体褐化率和污染率较低；MS+0.5 mg/L 6—BA+1.0 mg/L NAA+0.2 mg/L KT培养基中的愈伤组织诱导率最高，且生长势最强，MS+1.0 mg/L 6—BA+0.2 mg/L NAA+0.2 mg/L KT培养基中的出芽率最高；1/2MS+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L IBA培养基中生根率最高，可达76%。

关键词：天门冬（Asparagus cochinchinensis）；茎段；组织培养

中图分类号：S567.23+9；S339.4+1 文献标识码：A 文章编号：0439—8114（2012）19—4396—03

天门冬（Asparagus cochinchinensis（Lour.）Merr.）为百合科天门冬属的一种[1]，其药用块根性寒，味甘、苦，归肺、肾、胃经，具有养阴润燥、清肺生津等功能，是珍贵的药用植物。同时，作为一种重要的切叶植物和园林绿化植物，天门冬有广泛的种植前景。近年来，随着天门冬药材的需求量不断增大，乱挖滥采导致其野生资源日益枯竭，而天门冬的人工栽培虽然取得了一定的成果，但还未广泛推广[2，3]。目前，天门冬的栽培繁殖主要依靠分株繁殖和种子繁殖，分株繁殖增殖系数较低，成活率受诸多因素影响；种子繁殖发芽率低，并且发芽的整齐度不高，出苗所需时间长，种植时难以控制栽植时间，管理费时费工[4]。因此，开展天门冬组织培养技术研究，可解决种苗缺乏问题，有利于快速繁殖大量优质的无毒种苗，为天门冬的人工栽培、工厂化和规模化生产等奠定基础，具有重要的实际意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

采集广西药用植物园种质资源圃中天门冬植株的幼嫩茎段作为天门冬组织培养的外植体。

1.2 试验方法

1.2.1 HgCl2处理时间对外植体污染率和褐化的影响 取天门冬的幼嫩枝条，用自来水冲洗去掉残留在枝条上的碎泥等，剪成1.0～2.0 cm长的小茎段，放在加有1%洗洁精的洗涤液中浸泡5～8 min，在自来水下用细流水冲洗20 min。在超净工作台上用体积分数75%的乙醇消毒10～40 s，无菌水冲洗3～5次，1 g/L HgCl2分别处理5、7、10 min，再用无菌水冲洗5次，用棉布吸干部分水分后，切去末端部分组织，供接种用。

将经灭菌处理后未变色、无褐化的茎段接入MS+1.5 mg/L 6—BA+0.05 mg/L NAA+0.1 mg/L KT培养基中进行初代培养，接种3周后统计各处理外植体的污染率及褐化情况。

1.2.2 激素组合及浓度对天门冬愈伤组织和不定芽诱导的影响 当初代培养的不定芽长至0.5～1.0 cm高时，将其转入添加了不同浓度6—BA（0、0.5、1.0 mg/L）、KT（0、0.2、1.0 mg/L）和NAA（0、0.2、1.0 mg/L）的MS培养基中，20 d后统计各处理愈伤组织和不定芽的诱导率及生长情况。将获得的不定芽在MS+1.0 mg/L 6—BA+0.05 mg/L NAA+0.1 mg/L KT增殖培养基中进行增殖培养。

1.2.3 激素浓度对天门冬不定芽生根诱导的效果 以1/2MS为生根培养基，分别附加不同浓度的NAA（0、0.5、1.0 mg/L）和IBA（0、0.5、1.0 mg/L），进行生根培养。

2 结果与分析

2.1 HgCl2处理时间对外植体污染率和褐化率的影响

天门冬外植体的污染率随着1 g/L HgCl2处理时间的延长逐渐降低（表1），但褐变率呈上升趋势。灭菌5 min时，外植体污染率高达87.5%；只有几个极幼嫩的茎尖未出现污染；灭菌10 min时，灭菌效果最好，污染率大大降低，但同时褐变外植体个数也增多；灭菌7 min时，虽然污染率仍达17.5%，但诱导效果较好，腋芽萌发整齐。因此，天门冬外植体的HgCl2灭菌时间宜为7 min。

2.2 激素浓度组合对天门冬茎段愈伤组织和不定芽诱导的影响

除对照外，添加不同浓度激素的MS培养基均可诱导天门冬茎段产生愈伤组织（表2），愈伤组织诱导率为4%～36%，其中MS+0.5 mg/L 6—BA+1.0 mg/L NAA+0.2 mg/L KT培养基中的愈伤组织诱导率最高，且生长势最强。而从不定芽的诱导来看，MS+1.0 mg/L 6—BA+0.2 mg/L NAA+0.2 mg/L KT培养基中的出芽率最高，达到了92%（图1）。

2.3 激素浓度组合对天门冬不定芽生根的影响

天门冬不定芽在增殖培养基（MS+1.0 mg/L 6—BA+0.05 mg/L NAA+0.1 mg/L KT）中培养20 d左右，即可获得4～5倍的增殖系数（图2）。将高约2～3 cm的天门冬不定芽剪下接种到含不同浓度IBA和NAA的生根培养基中进行生根培养，25 d左右后，不定芽基部皮层形成4～6条粗细不一、长1～3 cm的不定根。从表3可以看出，不添加任何激素的1/2MS培养基不能诱导天门冬芽苗生根，单独添加IBA或NAA时，生根率均较低，为25%～49%。当0.5 mg/L IBA和0.5 mg/L NAA配合使用时，对生根有明显的促进作用，生根率达到76%，且生根速度也加快（图3）。

2.4 炼苗和移栽

炼苗方式、移栽基质和光照度对试管苗移栽成活率都有很大的影响。苗高约5 cm时开始炼苗，移栽前先把试管苗移出培养室，闭瓶炼苗6 d，再将培养瓶盖打开，在全天自然光照、温度25 ℃的通风条件下炼苗3～5 d，移栽时用镊子或玻璃棒将生根苗从培养瓶中取出，用清水洗干净根部残留培养基，移栽入已灭过菌的基质中（菜园土与河沙等体积混匀），移栽后7～10 d内用塑料薄膜保湿，光照强度以遮光率为60%左右最为适宜，保持空气湿度在85%以上，每天喷雾1次，14 d左右长出新根，每株平均根数为2～5条，30 d后试管苗移栽成活率达82%以上。

3 小结与讨论

天门冬作为中成药、化妆品、饮料及食品等的重要原料被广泛应用[5—7]，采用组培快繁技术可在短期内获得大量种苗。而在组培快繁过程中，HgCl2处理时间是影响植株茎段初期诱导的最重要因素之一，从理论上来说，HgCl2处理时间越长，灭菌越彻底，灭菌效果越好，但是灭菌时间过长会破坏外植体的组织结构从而引起褐变，降低外植体的成活率。为了尽量减少外植体褐化并获得较佳灭菌效果，1 g/L HgCl2处理时间宜为7 min。不添加激素的MS培养基不能诱导愈伤组织的形成，单独添加6—BA、KT或NAA，愈伤组织诱导率及出芽率均较低，最佳的愈伤组织诱导培养基为MS+0.5 mg/L 6—BA+1.0 mg/L NAA+0.2 mg/L KT；最佳的不定芽诱导培养基为MS+1.0 mg/L 6—BA+0.2 mg/L NAA+0.2 mg/L KT。天门冬不定芽的生根以IBA和NAA混合使用效果最好，最佳培养基为1/2MS+0.5 mg/L IBA+0.5 mg/L NAA。

试管苗的移栽成活在组培苗的生产中也非常关键，其在培养室内有人工提供的适宜温度、丰富的养分与充足的水分，因此移栽到自然环境中前需要进行炼苗，以提高存活率。根长为1 cm左右时移栽最佳，根过长容易折断，影响成活率。

参考文献：

[1] 汪发瓒，唐 进.中国植物志：第15卷[M].北京：科学出版社，1995.

[2] 欧立军，王俞人，刘佳蒙，等. 野生天门冬遗传多样性的ISSR分析[J]. 北方园艺，2011（16）：164—166.

[3] 赵 明. 我国天门冬研究的概况及展望[J]. 内江师范学院学报，2006，20（6）：52—55.

[4] 冉懋雄. 名贵中药材绿色栽培技术——黄连、天冬[M]. 北京：科学技术文献出版社，2002.191.

[5] 韦树根，马小军，柯 芳，等. 中药天冬研究进展[J]. 湖北农业科学，2011，50（20）：4121—4124.

[6] 邢东炜，张闽光. 天冬抗肿瘤作用研究概述[J]. 实用中医药杂志，2005，21（4）：253.

[7] 刘红昌，张 先，曾桂萍. 天门冬干物质积累动态研究[J]. 贵州农业科学，2010（2）：44—47.