通心络超微粉对急性脑梗死大鼠脑微血管的影响

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摘要：目的 观察通心络超微粉对急性脑梗死大鼠脑微血管的影响，探讨其脑保护的作用机制。方法 制作大鼠左侧大脑半球永久性大脑中动脉栓塞模型，随机分为假手术组、模型组、通心络组和丁苯酞组，每组再分为1、3 d 2个亚组。假手术组和模型组给予生理盐水灌胃，通心络组给予通心络超微粉灌胃，丁苯酞组给予丁苯酞灌胃。采用2，3，5-氯化三苯四唑染色检测大鼠脑组织梗死体积百分比，HE染色观察大鼠脑微血管的一般形态，免疫组化染色测定各组脑组织中血管生成素-1（ANG-1）、内皮抑素（ES）表达水平。结果 与模型组比较，通心络组和丁苯酞组的脑梗死体积百分比均减小，脑梗死灶面积明显减小，水肿程度减轻；与模型组比较，通心络组和丁苯酞组1、3 d测定ANG-1表达均升高（P

关键词：通心络超微粉；微血管新生；急性脑梗死；血管生成素-1；内皮抑素；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2014.05.019

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2014）05-0061-04

脑卒中具有发病率高、致残率高、死亡率高等特点[1]，急性缺血性脑卒中（脑梗死）是最常见的脑卒中类型，占全部脑卒中的60%～80%[2]，预防和治疗急性脑梗死的发病尤为重要。血管生成素-1（ANG-1）是作用最强、特异性最高的血管生成促进因子，内皮抑素（ES）是目前被认为最强的血管再生抑制剂，本实验主要观察通心络超微粉对大鼠脑缺血ANG-1和ES蛋白表达的影响，从而阐明通心络超微粉对急性脑梗死大鼠脑微血管的保护机制与ANG-1和ES蛋白表达的关系。

1 实验材料

1.1 动物

健康SPF级SD大鼠285只，雄性，体质量（250±20）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物许可证号：SCXK（京）2012-0001。常规饲养于北京中医药大学实验动物中心。

1.2 药物

通心络超微粉，河北以岭医药研究院提供，批号120109，按照临床用量与动物剂量换算1∶8，给药量为0.8 g/（kg・d），以0.5%羧甲基纤维素钠配制。丁苯酞软胶囊，石药集团恩必普药业有限公司提供，规格为0.1 g/粒，批号11050711，每粒含0.4 mL油性药液。按成人与动物剂量1∶7换算，剂量为0.28 mL/（kg・d），以花生油配制，均匀搅拌充分混合。

1.3 主要试剂与仪器

兔抗山羊ANG-1一抗（abcam公司），兔抗大鼠ES一抗（millipore公司），山羊抗兔/鼠通用二抗试剂盒（康为世纪公司）。电子分析天平（AE160型，瑞士Mettler公司），手术显微镜（SXP-1B，上海医用光学仪器厂），低温高速离心机（xiangyi L-550，SIGNA公司），光学显微镜（CH型，日本OLYMPUS公司），照相系统（Eclipse 50i型，日本尼康公司），显微图像分析系统（Image-pro plus 6.0，日本尼康公司）。

2 实验方法

2.1 造模

参考文献[3]方法制作大鼠左侧大脑半球永久性大脑中动脉栓塞模型。用10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉大鼠，颈部正中切口，结扎左侧颈外动脉（ECA）远心端，栓线阻断大脑中动脉，假手术组大鼠只结扎ECA远心端，不插入栓线阻塞血管。缝合手术切口后待大鼠清醒放回笼中饲养。

2.2 分组与给药

按Bederson等[4]神经功能法将大鼠随机分为模型组（70只）、通心络组（73只）、丁苯酞组（71只）及假手术组（71只）。其中通心络组和丁苯酞组分别按0.8 g/（kg・d）、0.28 mL/（kg・d）灌胃给药，假手术组和模型组给予等体积生理盐水灌胃。各组于术后6 h灌胃给药，然后于每日同时点重复灌胃。分别于1、3 d 2个时点处死大鼠并取材。

2.3 检测方法及观察指标

2.3.1 脑梗死体积检测 采用2，3，5-氯化三苯四唑（TTC）染色。大鼠断头取全脑后迅速置于-20 ℃冰箱中冻存15 min，冠状面均切为5片（每片厚度约2 mm）， TTC染色均匀后取出脑组织，置于盛有多聚甲醛液的小瓶内固定24 h，再进行照相、分析和数据处理。

2.3.2 脑微血管形态观察 采用HE染色。大鼠灌注固定后立即取脑，置于4%多聚甲醛液固定48 h后，石蜡包埋，于视交叉前缘开始作5 μm厚冠状切片。HE染色后光镜下观察其脑微血管形态学改变。

2.3.3 血管生成素-1、内皮抑素表达检测 切片制作同HE染色。行ANG-1、ES免疫组化染色，DAB显色，以梗死区细胞胞浆内出现棕黄色颗粒为阳性判定标准。在20倍光学显微镜下选取视野拍照，并进行图像分析，计算各因子表达的平均光密度并进行比较。

3 统计学方法

采用SPSS17.0统计软件进行分析。所有数据用―x±s表示，进行正态性检验，如正态分布数据用方差分析，若方差齐，两两比较采用最小显著差法，若方差不齐则采用Dunnett's T3检验行两两比较；如不符合正态分布，则用非参数检验进行统计。P

4 结果

4.1 通心络超微粉对大鼠脑梗死体积的影响

TTC染色后，假手术组大鼠脑切片未见白色梗死灶，模型组、通心络组、丁苯酞组均出现不同程度的白色梗死灶。与模型组比较，通心络组脑梗死体积均明显降低，差异有统计学意义（P0.05）。见表1。