MTT法测定棉酚对多浪羊淋巴细胞生长的影响
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摘要：通过mtt法测定棉酚对多浪羊淋巴细胞生长的影响，确定棉酚对多浪羊淋巴细胞产生影响的最短作用时间和最低浓度，用于指导生产实践。从新疆多浪羊外周血分离淋巴细胞，将其加入10 mL的 RPMI-1640中，均匀加入96孔细胞培养板中，于CO2 培养箱中37 ℃培养12 h后，分别以不同浓度（5、10、15、20、25、30、35 μmol/L）的棉酚进行作用，作用时间分别为1、2、3、4、5、6 h，加入MTT培养4 h，加入DMSO溶液终止反应，用酶联免疫检测仪于490 nm处检测各孔的吸光值。结果表明，随着棉酚作用浓度及作用时间的递增，多浪羊淋巴细胞活性在逐渐下降，说明棉酚对多浪羊的淋巴细胞活性有明显的抑制作用。
关键词：MTT；棉酚；新疆多浪羊；淋巴细胞；影响
中图分类号：S816.43 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）05-1098-04
The Effect of Gossypol on Lymphocyte Growth of Duolang Sheep by MTT
WANG Juan-juana，JIA Shan-linga，WAN Xin-junb，LI Lian-ruib
（Tarim University， a.College of Life Science； b.College of Animal Science， Alar 843300， Xinjiang，China）
Abstract： The effect of gossypol on the growth of Duolang sheep lymphocyte was detected by MTT assay. The object was to determine the shortest time and lowest concentration of gossypol on lymphocyte， and then used to practice. The lymphocyte was isolated from the peripheral blood of Xinjiang Duolang sheep， then added into 10 mL RPMI-1640 and even allocated to 96-well cell culture plate. After cultured in CO2 incubator at 37 ℃ for 12 h， the lymphocytes were treated with gossypol of different concentrations （5， 10， 15， 20， 25， 30， 35 μmol/L） for 1， 2， 3， 4， 5， 6 h， and then added MTT to culture 4 h. At last the reaction was stopped by adding DMSO solution. The absorbance of each well was detected by ELISA at OD490 nm . The results showed that the activity of Duolang sheep lymphocytes decreased with the increase of gossypol concentration and acting time. It indicated that gossypol had obvious inhibitory effect on the Xinjiang Duolang sheep lymphocytes.
Key words： MTT； gossypol； Xinjiang Duolang sheep； lymphocyte； effect
棉酚（Gossypol，GL）存在于锦葵科某些植物的根、茎、种子中，曾作为男性节育药为人们所熟知[1]。研究表明，棉酚还是一种新型的抗实体瘤药物[2]，化学结构为8，8′-二醛基-1，1，6，6′，7，7′-六羟基-5，5′-二异丙基-3，3′-二甲基-2，2′联萘，相对分子质量为518.54[3]，棉酚制剂主要有3种，分别为醋酸棉酚、精制棉酚及甲酸棉酚。棉酚具有明显的诱导肿瘤细胞凋亡的能力[4，5]。据统计，2010年新疆棉花产量为260万t，约占全国棉花总产量的40%，世界棉花总产量的11%。根据俄罗斯农业科学院有机化学研究所的一个科学小组研究发现，以往被人们认为废弃物的棉花的其他部分也是宝贵资源，利用其可生产出大约1 200种制剂、提炼出100多种有机化合物，同时也是畜禽饲料方面的好原料[6]；另外棉子饼同大米和小麦相比，不仅蛋白质含量高出5～8倍，棉子饼水解后还可得到17种氨基酸，是畜牧业生产中最物美价廉的蛋白质来源[7]，这就为新疆的农牧民提供了大量廉价的饲料资源，尤其是在新疆畜牧业的快速发展、蛋白质饲料短缺的局面越来越严重的情况下，大量废弃的棉子壳无疑是广大农牧民极为廉价的优质饲料。但由于棉子壳中含有棉酚类物质，当达到一定量时，会对动物机体产生毒害作用。研究棉酚引起动物细胞和组织中毒的最小剂量，对于最大限度地降低由于棉酚中毒而给畜牧业带来的损失具有重要的作用。
MTT比色法是一种检测细胞存活和生长的方法，其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能，二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490 nm波长处测定其光吸收度值，可间接反映活细胞数量。因此运用MTT法研究棉酚对新疆多浪羊淋巴细胞生长的影响能够为我们更进一步研究棉酚对细胞产生的影响提供重要的参考数据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验动物 多浪羊（Duolang sheep）由塔里木大学动物科技学院试验站提供。
1.1.2 试验药剂 青霉素（山西泰盛制药有限公司），链霉素（新泰生物有限公司），枸橼酸钠（塔里木大学畜牧科技学院重点实验室配制），人淋巴细胞分离液（中国医学科学院生物工程研究所）、MTT（噻唑蓝，上海普飞生物技术有限公司）；DMSO（二甲基亚砜，Sigma公司），RPMI-1640培养基（Gibco），PBS缓冲液。
1.1.3 仪器设备 电子天平（BS124S，北京市赛凝胶多利斯仪器系统有限公司）；超净工作台（SW-CJ-2F型，上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；全自动摄影生物显微镜（DP70+B10-OlysLIA，日本奥林巴斯）；电子万用炉（DL-1型，北京永光明医疗仪器厂）；紫外可见分光光度计（Golds54型，上海棱光技术有限公司）；PCR仪；电泳槽（DYCZ-28A ，北京六一仪器厂）；电脑三恒多用电泳仪（DYY-60C型，北京六一仪器厂）；凝胶成像分析系统（Tanon-4100，上海天能科技有限公司）。
1.2 试验方法
1.2.1 试剂的配制
1）MTT的配制：称取0.5 g MTT，加入 100 mL的PBS磷酸缓冲液（NaCl 8 g，KCl 0.2 g，Na2HPO4 1.44 g，KH2PO4 0.24 g，调节pH 为7.4，定容至1 L，用0.22 μm滤膜过滤除去溶液里的细菌，于4 ℃储存备用），配成浓度为5 mg/mL的 MTT储存液，于-20 ℃冰箱避光储存（注意：MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解）。进行试验的时候一般关闭超净工作台上的日光灯来避光较好。
2）RPMI-1640的配制：称取 0.062 5 g 青霉素（160 IU），0.1 g链霉素（100 IU），用10 mL灭菌蒸馏水溶解。将青霉素、链霉素混合液与RPMI-1640 （袋装粉剂）混合，灭菌蒸馏水定容至1 000 mL，调节pH至7.1左右，分装后于-20 ℃以下保存。
3）枸橼酸钠溶液配制：枸橼酸钠3.8 g溶于100 mL灭菌蒸馏水中。
4）无钙镁Hank’s液配制：①储存液：NaCl 0.80 g；KCl 0.4 g；Na2HPO4·12H2O 0.152 g； KH2PO4 0.06 g；葡萄糖0.10 g。将称量好的药品加灭菌蒸馏水，使各组分溶解后，加入0.4 %酚红溶液50 mL，加灭菌蒸馏水定容至100 mL，4 ℃冰箱保存。②应用液：临用前将原液用灭菌蒸馏水做10倍稀释，用无菌的5.5%的NaHCO3调节pH至7.2～7.4（配制时应注意所用的玻璃器皿必须洁净；各种药品称量应准确，要求用分析纯试剂；储存液可加入2 mL氯仿以抑制细菌生长，储存液配好后，瓶口须用橡皮塞塞紧，放4 ℃冰箱内保存，使用期最长为3个月；应用液配好后，经高压灭菌，4 ℃冰箱内保存，可供1个月内使用，用前需再次调整pH）。
1.2.2 MTT试验原理 活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶能够代谢还原MTT，同时在细胞色素C的作用下，生成蓝色（或蓝紫色）不溶于水的甲瓒（Formazan），甲瓒的多少可以用酶标仪在490 nm处进行测定。在通常情况下，甲瓒生成量与活细胞数成正比，因此可根据吸光度值推测出活细胞的数目。由于死细胞中不含琥珀酸脱氢酶，加入MTT后不会出现类似的反应，根据其对应的值就可反映出活细胞的相对情况。
1.2.3 试验步骤
1）淋巴细胞的分离。采集健康成年多浪羊新鲜抗凝血与Hank’s液等比例混匀，然后将混合液与淋巴细胞分离液按体积比2∶1混合后轻轻沿管壁加入玻璃管中，以2 000 r/min离心30 min后，可看见清晰的分层，分别为血浆层、淋巴细胞层、分离液层、红细胞层，用移液器小心将淋巴细胞层吸出，然后将淋巴细胞悬浮于10 mL RPMI-1640中轻轻混合均匀，分别依次加入96孔板中。
2）不同浓度棉酚作用于多浪羊淋巴细胞。将用DMSO（二甲基亚砜）助溶的50 mmo/L的棉酚储存液取出，将其加入RPMI-1640稀释的淋巴细胞悬液中，为确保棉酚的作用时间分别为1、2、3、4、5、6 h，而MTT的作用时间为4 h，从96孔板的右边第11、12列开始加入棉酚，从上到下（即第1排到第8排，下同）依次加入棉酚，使得棉酚的终浓度分别为0、5、10、15、20、25、30、35 μmol/L，然后放入37 ℃、CO2浓度为5%的细胞培养箱中培养，此时加入棉酚以确保棉酚对新疆多浪羊淋巴细胞的作用时间为6 h。
在第二小时的时候，将96孔板细胞培养板从CO2培养箱中取出，按上述方法在第9、10列加入棉酚，终浓度按从上到下分别为0、5、10、15、20、25、30、35 μmol/L ，此时加入棉酚以确保棉酚对新疆多浪羊淋巴细胞的作用时间为5 h，然后将96孔细胞培养板放入37 ℃、CO2浓度为5%的细胞培养箱中继续培养。
在第三小时的时候，按上述方法在第7、8列加入棉酚，此时可确保棉酚对新疆多浪羊淋巴细胞的作用时间为4 h。此时，将配制好的5 mg/mL的 MTT储存液取出，用排枪从96孔板从右往左每孔加入20 μL MTT溶液，这是MTT与细胞作用的第一小时，然后再将96孔板放入37 ℃、CO2浓度为5%的细胞培养箱中继续培养。
在第四小时的时候，依照上述方法，在第5、6列加入棉酚，使棉酚的终浓度分别为0、5、10、15、20、25、30、35 μmol/L，此时，MTT的作用时间为2 h。同样，第五和第六小时也按照上述方法加入棉酚，这样，既确保了棉酚的作用时间分别为1、2、3、4、5、6 h，也可以保证MTT的作用时间达到4 h，然后放入37 ℃、CO2浓度为5%的细胞培养箱中培养。
3）DMSO终止培养。每孔加入150 μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在490 nm处测量各孔的吸光值。每个时间点各设2个重复，同时设空白对照。
2 结果与分析
2.1 棉酚对新疆多浪羊淋巴细胞生长的影响
2.1.1 棉酚不同作用时间对新疆多浪羊淋巴细胞活性的影响 从表1和图1中可以看出，随着棉酚作用时间的递增，新疆多浪羊淋巴细胞吸光度值在2 h以内呈现递增趋势，并在2 h时达到峰值。2 h以后，随着时间的进一步递增，新疆多浪羊淋巴细胞的吸光度值呈现递减的趋势，且均小于对照。这是由于活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中（死细胞无此功能），所以，MTT所测得的吸光度值越大，表明其活细胞的含量越高，活性越强。试验结果表明棉酚在作用2 h的时候，新疆多浪羊淋巴细胞的活性最大，随后，由于棉酚进入细胞，长时间的作用对细胞造成了损伤，细胞自身的修复作用并不能维持其自身活性，其酶活力下降，甚至有大量的细胞出现了凋亡。
2.1.2 棉酚不同作用浓度对新疆多浪羊淋巴细胞活性的影响 图2为不同作用浓度的棉酚对新疆多浪羊淋巴细胞吸光度值的影响结果。由图2可见，在棉酚浓度为5～15 μmol/L的范围内，新疆多浪羊淋巴细胞吸光度值表现为递增，且在15 μmol/L的浓度下达到最大，以后则一直呈现递减，在35 μmol/L的棉酚浓度下，其吸光度值达到了最低。这主要是因为在棉酚浓度为5 μmol的时候，对新疆多浪羊淋巴细胞产生较大程度的损伤，但是随着其浓度的递增，新疆多浪羊淋巴细胞本身的免疫系统会随着外源不利因素的递增而出现自身功能性的修复作用，此时细胞的活性会增强，代谢能力也会加强，同时，随着棉酚作用时间的递增，新疆多浪羊淋巴细胞在CO2培养箱中也会生长，尤其是在新疆多浪羊淋巴细胞的对数生长期，其细胞个数会增多，体积会变大，所以相应细胞活力也会增强，活细胞的个数也会增多，此时新疆多浪羊淋巴细胞的吸光度值就会出现短暂的递增。但随着棉酚浓度的进一步增大，对新疆多浪羊淋巴细胞的损伤程度也达到了最大，其自身的修复作用已经不能维持正常的生理活动，此时测得的吸光度值就会递减，且在35 μmol/L的浓度下其吸光度值达到最低。
2.2 分析
在棉酚不同浓度及不同时间作用下，棉酚对新疆多浪羊外周血淋巴细胞产生了不同的影响。本试验结果表明，随着棉酚作用浓度的增大，在2 h作用时间范围内，新疆多浪羊外周血淋巴细胞的吸光度值是逐渐增大的，而在2 h以后，新疆多浪羊外周血淋巴细胞的吸光度值递减，说明在2 h内新疆多浪羊淋巴细胞的活性还能维持自身的生长需要，2 h以后则会影响新疆多浪羊淋巴细胞的正常生理功能。而在大于15 μmol/L的棉酚浓度下，会使新疆多浪羊淋巴细胞丧失某些生理功能，活细胞的个数减少，部分生理机能也会丧失。从总体的趋势来看，棉酚的作用时间应该控制在2 h以内、浓度控制在15 μmol/L的范围以内，否则可能会对新疆多浪羊的生理机能产生一定的影响。
3 讨论
Kainz等[8]提出，棉酚是一种抑制剂，不仅会抑制DNA的合成，对于RNA及蛋白质的合成都具有明显的抑制作用，Balakrishnan等[9]的试验也证明棉酚作为一种BH3类物质，通过与抗凋亡蛋白的结合诱导慢性淋巴细胞白血病细胞的凋亡，并且也有研究证明棉酚可以引起心肌细胞内质网扩张并且使溶酶体的数量增加[10]。在本试验中，随着棉酚浓度的加大和作用时间的延长，新疆多浪羊外周血淋巴细胞的酶活力值越来越小。甲瓒类物质的作用原理是通过MTT作用于（细胞）线粒体，采用酶联免疫检测仪检测其酶活力的大小，可在一定程度上反映棉酚对细胞的损伤情况。可将其作为在饲喂动物棉子壳时的参考依据之一。棉酚也可以作为雌性动物生殖的抑制剂，在牛的黄体细胞培养中，10 μg/mL的棉酚可以抑制hCG刺激的孕酮合成及cAMP合成，并且会与细胞膜相结合。大鼠体外受精卵的培养中，浓度为3～30 μg/mL的棉酚可以明显降低发育到二原核期的卵细胞数，当棉酚的浓量达到一定程度，尤其是大剂量的棉酚会扰乱雌性动物的动情周期，阻止受精卵的发育[11，12]，并且其着床率也会大大降低。有报道称棉酚对卵巢内分泌及子宫和胚胎均具有一定的毒性[13]。此外，棉酚能与蛋白质中赖氨酸的s-氨基酸结合，可大大降低赖氨酸的有效成分，降低其营养价值。因此本试验结果对于以棉子壳作为家畜主要饲料的农牧地区具有重要的参考作用。
参考文献：
[1] BADER P，NIEMEYER C，WILLASCH A，et al. Children with myelodysplastic syndrome （MDS） and increasing mixed chimaerism after allogeneic stem cell transplantation have a poor outcome which can be improved by pre-emptive immunotherapy[J]. Br J Haematol，2005，128（5）：649-658.
[2] BUSHUNOW P，REIDENBERG M M，WASENKO J， et al. Gossypol treatment of recurrentmalignant gliomas[J]. J Neurooncol，1999，43（1）：79-86.
[3] 梁 璐，汪森明，胡喜钢，等.醋酸棉酚对人鼻咽癌细胞凋亡的影响及其作用机制探讨[J].实用医学杂志，2008，24（7）：1099-1101.
[4] TUSZYNSKI G P， COSSU G. Differential cytotoxic effect of gossypol on human melanoma， colon carcinoma， and other tissue culture cell lines [J]. Cancer Res，1984，44（2）：768-771.
[5] WANG X，WANG J，WONG S C，et al. Cytotoxic effect of gossypol on colon carcinoma cells[J]. Life Science，2000， 67（22）：2663-2671.
[6] 张肇富.棉花废弃物在饲料方面的应用[J].国外饲料，1999（1）：27.
[7] 王 飞，米海峰.棉籽饼粕中棉酚对动物机体的毒害作用及其预防措施[J].粮食与饲料工业，2003（8）：27-28.
[8] KAINZ P，NUSSBAUMER V，FRICK J，et al. Effect of gossypol on macromolecular synthesis in rat testis. An in vitro study[J]. Controception， 1985，31（2）：151-158.
[9] BALAKRISHNAN K， WIERDA W G， KEATING M J， et al. Gossypol， a BH3 mimetic， induces apoptosis in chronic lymphocytic leukemia cells [J]. Blood，2008，112（5）：1971-1980.
[10] 薛社普.男用节育药棉酚的实验研究[M].北京：人民卫生出版社，1983.
[11] LIN Y C， SANBUISSHO A， COSKUN S， et al. Inhibition of in vitro fertilization and early embryonic development in hamsters by gossypol[J].Life Sci，1994，55（14）：1139-1145.
[12] MIRANDA F J，THRREGROSA G，SALOM J B，et al. Endothelial modulation of 5-hydroxytryptamine-induced contraction in goat cerebral arteries[J].General Pharmacol，1993， 24（3）：649-653.
[13] 卢清显，陈啸梅，刘 平.雷公藤单体（T-4）与棉酚抗生育机理及毒性作用的比较[J].中国医学科学院学报，2000，12（6）：440-443.