穿心莲内酯衍生物炎琥宁对大鼠体内白念珠菌生物膜的影响
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[摘要] 目的：探讨穿心莲内酯（AG）衍生物炎琥宁（YHN）对大鼠体内白念珠菌生物膜的影响。方法：构建白念珠菌生物膜大鼠皮下导管模型，采用YHN（40，20，10，5，2.5 mg・kg-1）腹腔注射治疗，设氟康唑（FLC）阳性对照组（80 mg・kg-1），7 d后计数导管的菌落形成单位（CFU），XTT代谢法评估YHN对体外白念珠菌生物膜的影响；扫描电镜（SEM）观察YHN干预大鼠体内生物膜的形态变化；采用实时荧光定量PCR法检测白念珠菌黏附相关基因ALS1，ALS3，HWP1，EAP1和MP65的表达量。结果：YHN组导管片上CFU明显少于空白组；XTT代谢活性也显示YHN组低于空白组，且呈剂量依赖性；扫描电镜照片显示YHN能显著减少白念珠菌对大鼠体内导管的黏附；qRT-PCR结果显示，YHN可下调ALS1，ALS3，HWP1，EAP1和MP65的表达量。结论：YHN能抑制大鼠体内白念珠菌生物膜。
[关键词] 穿心莲内酯；炎琥宁；白念珠菌；生物膜；体内模型
[收稿日期] 2013-12-22
[基金项目] 国家自然科学基金项目（81073127）；安徽中医药大学自然科研项目（2013zr009，2013RC001）
[通信作者] 汪长中，教授，Tel：13956096007，E-mail：
[作者简介] 施高翔，硕士研究生，Tel：13956962627，E-mail：
白念珠菌Candida albicans是临床最常见的条件致病性真菌，可引起多种浅表及深部真菌病。近年来由于广谱抗生素等的广泛应用以及器官移植和介入性诊疗技术的普遍开展，真菌感染中由念珠菌所致的机会性感染高达73.4%，其中又以白念珠菌感染最为常见[1]。白念珠菌的致病性与其形成生物膜密切相关 。Chandra J等[2]将白念珠菌生物膜的形成划分为 3个阶段：早期以酵母相黏附于介质表面；中期白念珠菌细胞分泌细胞外多聚基质（ECM）覆盖于菌落表面；成熟期可见ECM包裹着细胞，内有大量菌丝生长。相对于浮游菌，白念珠菌生物膜的一个重要特征是其对临床抗真菌药物的高度耐药性。
我国中草药资源极其丰富，其在防治念珠菌感染中显示了较好的优势。炎琥宁注射剂为穿心莲内酯（AG）二琥珀酸半酯钾钠盐，可直接溶于水，药理研究及临床应用表明其具有抗菌、抗病毒等作用[3]。本课题组在前期研究中发现，中药单体AG（andrographolide，AG）及其衍生物对白念珠菌生物膜具有一定的抑制作用[4]。本实验通过构建大鼠皮下导管白念珠菌生物膜模型，初步探讨AG衍生物炎琥宁（YHN）体内抗白念珠菌生物膜作用。
1 材料
1.1 菌株与试剂 白念珠菌C. albicans SC5314由第二军医大学药学院姜远英教授惠赠。炎琥宁（AG的脱氢琥珀酸半酯钾钠盐，批号13500783，重庆药友制药有限责任公司，以下简称YHN）；氟康唑（中国食品药品检定研究院，批号100314）；25%戊二醛溶液（国药集团化学试剂有限公司，批号20131012）；地塞米松磷酸钠注射液（5 g・L-1，辰欣药业股份有限公司）；RPMI-1640培养基（美国Gibco公司）；XTT [2，3-bis（2-methoxy-4-nitro-5-sulfo-phenyl）-2H-tetrazolium-5-carboxanilide]（加拿大BBI公司）；维生素K3（美国Alexis公司）。
1.2 仪器 Spectra Max M2e多功能酶标仪（美国Molecular Devices公司）；96孔培养板（美国Corning公司）；扫描电镜（scanning electron microscopy，SEM，Sirion 200，荷兰FEI公司）；离心机（长沙英泰仪器有限公司）。
1.3 动物 健康清洁级雌性Sprague-Dawley（SD）大鼠84只，体重（200±20） g，购于安徽医科大学实验动物中心。随机分为 7组：空白对照组、YHN组（40，20，10，5，2.5 mg・kg-1）、氟康唑（FLC）阳性对照组（80 mg・kg-1），每组12 只；实验前3 d至实验结束以1 mg・L-1地塞米松掺入大鼠饮用水中进行免疫抑制。
2 方法
2.1 白念珠菌悬液和导管片的制备[5] 从4 ℃保存的白念珠菌沙氏培养基上挑取单菌落白念珠菌，接种至6 mL 1640培养液，于37 ℃恒温培养箱孵育16 h，再次活化，16 h后用血细胞计数板计数，以RPMI-1640培养基稀释浓度至2×106CFU/mL备用。将医用聚氨酯导管（直径2.4 mm）裁割成长1 cm的导管片，75%乙醇过夜消毒，再以新生牛血清浸泡37 ℃过夜，用PBS轻轻冲洗2次待用。
2.2 体内生物膜模型的构建 将聚氨酯导管片置于1×106 CFU/mL白念珠菌中浸泡3 h，用PBS缓冲液轻轻冲洗2次待用。各组大鼠以3.5%水合氯醛溶液麻醉后背部刮毛，并以2%碘酊和75%乙醇消毒，以手术刀切开背部皮肤2 cm长度，将2根导管片放置于皮下，缝合皮肤后以2%碘酊和75%乙醇棉消毒。导管留置48 h后，按不同组别对大鼠分别给予不同浓度的YHN腹腔注射7 d，设空白对照组和氟康唑阳性对照组。回收导管片时，同样先以3.5%水合氯醛溶液麻醉大鼠后，乙醇消毒创口，从皮下组织取出导管片标本，以无菌PBS冲洗，去除表面附着的动物组织、红细胞和未附着的游离菌体，将导管片置入2 mL PBS缓冲液中备用。一根用作菌落计数，评价白念珠菌生物膜在体内代谢活性，同时进行SEM观察。
2.3 体内生物膜CFU计数实验 从体内将导管片取出，用PBS冲洗2次后，振荡仪涡旋30 s，超声仪4万Hz超声10 min，使生物膜从导管片上脱离下来。将菌悬液按照1∶10连续稀释后，取50 μL洗液均匀涂抹于沙氏琼脂平皿，37 ℃培养48 h后计数CFU。实验重复3次，取平均值。
2.4 XTT法检测体内生物膜的活性 以0.5 g・L-1林格液配制XTT并用0.22 μm的过滤器过滤除菌，临用加入维生素K3（menadione，用丙酮稀释至终浓度10 mmol・L-1）。将体内导管片取出后，用PBS冲洗2次后，振荡仪涡旋30 s，超声仪4万Hz超声10 min，取200 μL PBS洗涤液加入96孔板，加XTT-Vk3溶液100 μL，37 ℃避光培养2 h。酶标仪492 nm检测吸光度A。实验重复3次，取平均值。
2.5 扫描电镜检查体内生物膜 将待检测的导管片标本取出，PBS缓冲液洗1次，3%戊二醛溶液中固定3 h，以PBS缓冲液冲洗2次，乙醇梯度脱水（30%，10 min；50%，10 min；70%，10 min；95%，10 min； 100%，20 min），醋酸异戊酯置换，常规临界点干燥，IB-5离子溅射仪中镀金，SEM观察并拍照。
2.6 YHN对体内白念珠菌黏附相关基因表达的测定[6] 总RNA的提取：基因表达实验检测YHN对白念珠菌黏附相关基因ALS1，ALS3，HWP1，EAP1，MP65的在体内表达的影响。将体内取出的导管片冲洗下的PBS清洗液，3 000 r・min-1离心5 min收集菌体，用PBS缓冲液冲洗3次后进行总RNA提取。提取过程参照ToyoBo公司MagExtractor-RNA提取试剂盒说明书进行。
引物的设计与合成：据NCBI基因库查得基因序列，并用Primer Premier 5.0软件设计引物，委托上海生工生物工程有限公司合成引物（表1）。
逆转录成cDNA：检测A260/A280，调节RNA浓度，使菌体模板量一致。依ToyoBo公司逆转录试剂盒说明书，将提取的总RNA反转录成cDNA。
实时荧光定量PCR反应：按SYBR Green Real-time PCR Master Mix试剂盒（ToyoBo公司）配制反应液（共25 μL）：2×SYBR Green Master Mix（12.5 μL）、上下游引物（各1 μL）、cDNA（0.5 μL）和DEPC H2O（10 μL）。反应条件设置为：预变性（95 ℃ 1 min），变性（95 ℃ 15 s），退火（55 ℃ 15 s），延伸（72 ℃ 45 s），共40个循环。采用ABI7000荧光定量PCR仪进行扩增反应。实验重复3次，取平均值。
实时荧光定量PCR分析：以ACT1为参照，分别测定每个样品目的基因的Ct值。结果应用软件Graphpad Prism 5.0进行分析，基因表达水平用倍数变化（fold change）来表示（2-ΔΔCt法）。
2.7 统计学处理 数据采用SPSS 17.0作统计学处理，计量资料以±s表示，组间差异比较采用One-Way ANOVA检验，以P
3 结果
3.1 YHN对大鼠体内白念珠菌生物膜活性的影响 2.5 mg・kg-1YHN对体内白念珠菌生物膜活性无影响，5，10，20，40 mg・kg-1YHN组能显著抑制体内白念珠菌生物膜的代谢活性（P
3.2 YHN对大鼠体内导管片CFU的影响 通过将体内导管片上的生物膜振荡下来，计数其CFU，可见5，10，20 mg・kg-1YHN能显著的抑制体内白念珠菌生物膜，其中2.5 mg・kg-1YHN 组CFU与对照组无显著性差异，40 mg・kg-1YHN组CFU数与FLC组接近（图2）。
3.3 YHN对大鼠体内白念珠菌生物膜形态结构的影响 通过扫描电镜观察体内白念珠菌生物膜形态结构，发现对照组菌丝和酵母相密集交织，已形成成熟的生物膜结构，2.5，5，10 mg・kg-1YHN能剂量依赖性地抑制白念珠菌生物膜的形成，其中2.5 mg・kg-1组白念珠菌生物膜与对照组较接近，菌丝相与酵母相交织初步形成生物膜结构，而20，40 mg・kg-1YHN能明显抑制体内白念珠菌生物膜的形成，只见酵母相的白念珠菌（图3）。
3.4 YHN对白念珠菌黏附相关基因表达影响 qRT-PCR实验结果显示，20，40 mg・kg-1YHN使ALS1基因表达下调2.4，3.3倍；10，20，40 mg・kg-1YHN使ALS3基因表达下调2.1，2.7，3.6倍；10，20，40 mg・kg-1YHN使HWP1基因表达下调3.8，5.8，6.6倍；40 mg・kg-1YHN使EAP1基因表达下调3.1倍；20，40 mg・kg-1YHN使MP65基因表达下调2.2，2.3倍（图4）。
4 讨论
白念珠菌作为常见的人类致病真菌，可以导致浅表和系统性深部感染。随着医用植入材料的广泛使用，白念珠菌可以黏附于人类组织器官以及内置的生物材料，形成结构复杂的生物膜进而耐药。有研究报道[7]，白念珠菌形成生物膜后对氟康唑、两性霉素B的敏感性下降几十至几百倍，目前临床对白念珠菌的生物膜相关感染治疗尚无理想对策，一旦发生，通常不得不取出人工的医疗装置。生物膜是导致高度耐药性和临床白念珠菌反复感染的直接原因，引起高发生率的导管相关性感染，增加治疗费用，延长治疗周期。
白念珠菌动物模型的构建可以较好地阐释白念珠菌生物膜与宿主细胞间的关系，包括白念珠菌的黏附以及生物膜的形成等过程。实验将黏附有白念珠菌的医用导管材料植于大鼠背部皮下组织，构建了白念珠菌体内生物膜模型。本课题组前期研究表明，AG在体外能明显抑制白念珠菌的黏附[8]，介导白念珠菌的凋亡[9]。鉴于AG的溶解性较差，故在体内试验中本实验以临床上常用的具有抗微生物活性的YHN（炎琥宁，AG的二琥珀酸半酯钾钠盐）作为大鼠体内模型的干预药物进行实验。体内实验发现，与对照组相比，YHN能显著的抑制体内白念珠菌生物膜的活性，CFU计数实验也证实，YHN能明显减少大鼠皮下导管上的白念珠菌，与对照组的CFU有明显差异，其中40 mg・kg-1组接近于氟康唑阳性对照组，另经SEM观察显示，40 mg・kg-1的YHN组导管表面生物膜不完整，而对照组白念珠菌生物膜成熟，形态完整，且菌丝相和酵母相致密交织。
通过前面实验发现，YHN有较好的抗体内白念珠菌生物膜作用，因此从基因层面进一步来探讨其作用机制，检测与白念珠菌黏附相关的5个主要基因表达情况。
ALS（agglutinin like sequence，ALS）基因家族编码白念珠菌细胞壁表面糖蛋白，它们所编码的GPT锚定蛋白参与白念珠菌的黏附过程[10]。ALS1产物是细胞表面的一种糖蛋白，在体外主要介导白念珠菌与宿主细胞的黏附[11]。ALS3产物也是一种编码细胞壁表面蛋白，它可能参与了白念珠菌由酵母相向芽管相转换及生物膜形成过程[12]。HWP1（hyphal wall protein 1 gene，菌丝胞壁蛋白基因） 产物是黏附素，是白念珠菌生物膜形成中重要基因之一，参与编码GPI锚定的细胞壁蛋白，能够促进白念珠菌细胞对宿主细胞的黏附；HWP1还参与生物膜的形成过程，与野生型菌株相比，缺失菌株形成的生物膜所分泌的大分子多聚物及代谢产物等相对较少[13]。EAP1（enhanced adherence to polystyrene）编码的产物富含丝氨酸/苏氨酸的区域，可作为糖基化的位点，EAP1基因缺失的菌株在体外只能形成由数层酵母细胞组成的被膜[14]。MP65（65-KD mannopr otein，甘露糖蛋白 65）产物是白念珠菌细胞壁主要成分，参与葡聚糖及黏附素合成[15]。
针对上述白念珠菌黏附相关基因进行qRT-PCR实验，结果显示高剂量组YHN（40 mg・kg-1）使ALS1，ALS3，HWP1，EAP1 和MP65基因表达下调3.3，3.6，6.6，3.1，2.3倍，显著的抑制了白念珠菌黏附相关基因的表达；菌丝是形成完整生物膜的重要组成部分，而与菌丝相关的基因ALS1和ALS3表达均有不同程度的下调，这也解释了YHN对白念珠菌生物膜形成有较强抑制作用；其中以HWP1表达下调最明显，10，20，40 mg・kg-1的YHN分别使其下调3.8，5.8，6.6倍，这也证实了HWP1基因对白念珠菌生物膜形成有较大影响；另外，40 mg・kg-1的YHN才能使EAP1 表达下调3.1倍，其他剂量组使其下调倍数均在2倍以下，推测EAP1基因表达产物或只影响白念珠菌生物膜的完整性；对MP65基因表达影响不明显。由此推测YHN对白念珠菌生物膜的影响，可能是其抑制或干扰了白念珠菌黏附相关基因的转录以及表达，从而抑制白念珠菌黏附及生物膜的形成。
YHN作为中药单体AG的衍生物，临床常用于抗病毒的治疗，目前尚无关于其抗真菌尤其是抗体内白念珠菌生物膜方面的研究，本研究提示YHN或具有临床治疗白念珠菌生物膜相关感染性疾病的潜在价值。
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Effect of andrographolide derivative Yanhuning on in vivo
Candida albicans biofilms in rats
SHI Gao-xiang， YAN Yuan-yuan， SHAO Jing， ZHANG Meng-xiang， LU Ke-qiao， WANG Tian-ming， WANG Chang-zhong
（1. School of Integrated Traditional and Western Medicine， Anhui University of Chinese Medicine， Hefei 230038， China；
2.Institute of Integrated Chinese and Western Medicine， Anhui Academy of Chinese Medicine， Hefei 230038， China）
[Abstract] Objective： To investigate the effect of andrographolide derivative Yanhuning （YHN） on Candida albicans biofilms in rats. Method： The rat C. albicans biofilms subcutaneous catheter model was established by intraperitoneally injecting YHN （40， 20， 10， 5， 2.5 mg・kg-1）， with the FLC （80 mg・kg-1） positive group as the control group. After 7 d， CFU counting and XTT assay were used to evaluate the effect of YHN on C. albicans biofilms in vivo. Scanning electron microscopy （SEM） was applied to observe the morphological changes in rat biofilms intervened by YHN. The real-time fluorescence quantification PCR was adopted to detect expressions of C. albicans adhesion-related genes， such as ALS1， ALS3， HWP1， EAP1 and MP65.Result： The YHN group showed much less CFUs on catheter pieces and lower XTT metabolic activity than the blank group， with dosage dependence. SEM also showed that YHN could obviously decrease C. albicans adhesion on subcutaneous catheters in rats. According to qRT-PCR′s results， YHN can down-regulate expressions of ALS1， ALS3， HWP1， EAP1 and MP65. Conclusion： YHN could inhibit C. albicans biofilms in rats.
[Key words] andrographolide； Yanhuning（YHN）； Canidia albicans； biofilm； in vivo model
doi：10.4268/cjcmm20141525