西维来司钠对大鼠脑出血后脑水肿的影响

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摘要:目的 探讨西维来司钠（sivelestat sodium）对胶原酶（collagenase）所诱导的大鼠脑出血（ICH）后脑水肿的影响。方法 将Wistar大鼠随机分为假手术对照组、ICH模型组、西维来司钠治疗组与尼莫地平治疗组。造模后4h、8h、12h、24h进行大鼠的行为学评分、脑组织病理观察、脑含水量（brain water content,BWC）以及脑伊文思兰（Evans Blue，EB）含量测定。 结果 与模型组比较，西维来司钠治疗组 ICH大鼠行为学评分显著降低、出血侧脑细胞的病理损伤减轻、BWC含量降低、EB含量降低。结论 西维来司钠对胶原酶所引起的大鼠ICH脑水肿具有较好的保护作用。

关键词 脑出血 脑水肿 西维来司钠

TheEffectofSivelestatonHydrocephalusafter Rats’ CerebralHemorrhage.Liu Quan, Dong Zhi, Wang Guang-zhen.Chongqing University of Medical Sciense,Chongqing 400016, China.

【Abstract】Objective To explore the effect of sivelestat on hydrocephalus after rat’s intracerebral hemorrhage(ICH) induced by collagenase.Methods to randomly divide Wistar rats into virtual operation group,ICH model group,sivelestatmedical treatment group and nimodipine medical treatment group.Molded for 4 hours,8h,12h and 24h,the rats are conducted behavioral scoring,pathological observation on cerebral tissues,measurement of brain water content (BWC) as well as Evans Blue(EB) content.Results compared with those in model group,the behavioral scores of ICH rats in sivelestatgroup significantly decreased, with pathological injuries of cerebral cells in ICH side lessened,BWC content and EB content reduced.Conclusion sivelestat plays a very important role in the protection of the hydrocephalus after rat’s ICH induced by collagenase.

【Key Words】ICH;hydrocephalus;sivelestat sodium

西维来司钠（sivelestat sodium）是一个小分子多形核粒细胞弹性蛋白酶（NE）抑制剂，能可逆性且竞争性地抑制NE。临床研究证实，西维来司钠通过抑制中性粒细胞释放的弹性蛋白酶，改善伴有全身性炎症反应综合症（SIRS）的急性肺损伤（ALI）患者的呼吸功能。其主要机制可能是［1-3］:直接抑制NE的合成和释放，减少活化的中性粒细胞介导的肺泡上皮细胞和血管内皮细胞损伤；降低肺血管内皮细胞的通透性，减少血栓调节素的释放，降低肺动脉压和肺的通透性；抑制人单核细胞的致炎症因子如IL-β、IL-6、肿瘤坏死因子（TNF-α）的产生等。国外已有报道西维来司钠能够改善脑缺血/再灌注引起的脑水肿、脑损伤及炎症反应。本文拟观察西维来司钠对大鼠脑出血后脑水肿的影响，为其新的临床应用提供依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 Wistar大鼠，雌雄各半，体重180-250g，由重庆医科大学实验动物中心提供。术前12h禁食,自由饮水。

1.2 主要试剂和药品 Ⅶ型胶原酶(美国Sigma公司),水合氯醛(苏州正兴化工厂), 西维来司钠(Sivelestat sodium,重庆医药工业研究院, 分子式 C20H21N2O7Na.4H2O）, 尼莫地平(Nimodipine, 山东泰安制药厂)。

1.3 主要仪器 立体定位仪(西北光学仪器厂),微量注射器(上海保西玻璃仪器厂), 恒温干燥箱(重庆实验仪器厂), 电子分析天平(Sartorius,German), 显微镜 H-2(日本OLYMPUS)。

2 方法

2.1 实验动物分组 动物随机分成五个组即：假手术组（sham）；ICH+生理盐水组（model）；ICH+ Sivelestat300mg/kg组(S1)；ICH+Sivelestat150mg/kg组(S2)；ICH+Sivelestat75mg/kg组(S3)；ICH+Nimodipine0.5mg/kg组(nimodipine)。每组又分为4h,8h,12h,24h四个时间点亚组。生理盐水、sivelestat和nimodipine于ICH造模前30min经大鼠尾静脉给药，每日一次，缓慢注射，药液总量控制在1 ml/200g体重；生理盐水也按1 ml/200g体重给予。每组Wistar大鼠7只。

2.2 大鼠ICH模型的建立 参照Rosenberg等［4］报道的方法，操作步骤如下：实验鼠经水合氯醛(350mg/kg)腹腔麻醉后，仰卧位固定于立体定位仪上，于前囟后1 mm，中线向左旁开3 mm处用五号针头钻一直径大约为0.5mm的小孔，深达硬脑膜。用固定于立体定位仪上的微量注射器沿钻孔进针，进针深度为5.8 mm(即尾状核位置)，缓慢注射胶原酶Ⅶ0.5U(用生理盐水配制成1U/μl)。注射时间为3min，注射完后留针5min再退针，然后缝合皮肤，回笼饲养。假手术组插针后注射0.5μl的生理盐水,其余操作一样。

2.3 观察指标

2.3.1 神经病学评分 动物苏醒后，各组均参照Bederson等［5］的神经缺损分级评分标准立即进行神经功能缺失评分，3分及以上动物入选本实验。标准如下： 无任何症状或仅有同侧眼裂缩小为0级评0分; 提尾时对侧肢体屈曲内收为Ⅰ级评1分；抗侧方推力减弱并伴有Ⅰ级症状为Ⅱ级评2分；爬行时向对侧划圈并伴有Ⅱ级症状为Ⅲ级评3分；意识丧失不能行走为Ⅳ级评4分。术后动物分笼饲养，正常进食进水，室温控制在20-25℃。以后于造模后4h、8h、12h、24h进行评分。

2.3.2 脑BWC测定 各组动物在预定的时间点，经水合氯醛麻醉后，迅速断头取脑，将取出的脑组织放在已经用生理盐水湿润过的滤纸上，以防止水分蒸发。去除软脑膜和血迹，以进针孔为中心，切取出血侧前半部脑组织相同部位的皮层和基底节，精密称重（精确到0.1mg）。取脑到称完重量时间控制在5min内。然后置于95℃恒温烘箱24h，再称取干重。按Blliot公式计算脑含水量：BWC=（湿重-干重）/湿重×100%。

2.3.3 ICH大鼠脑组织EB含量的测定 于各实验组相应时间点前2小时经大鼠尾静脉注射2%EB生理盐水溶液（2 ml/kg），注射几秒钟后大鼠眼球结膜、四肢等均显示蓝色，表明注射成功。2小时后断头处死，以针孔为中心取出血侧脑后半部相同部位的皮层和纹状体100 mg左右，精密称量，按3 ml/100mg湿脑组织加甲酰胺，加盖避光在54℃恒温水浴箱中孵育24小时，使组织中的EB充分溶解在甲酰胺溶液中，将溶有EB的甲酰胺溶液过滤，滤液用分光光度计于632nm波长测定其光密度值。用倍比稀释法制作标准曲线，再根据标准曲线求得脑组织EB含量。组织伊文思蓝量表示为每100 mg脑组织伊文思蓝外渗量，即μg/100 mg脑组织。

2.4 组织病理学观察 随机选取各组动物，于预定的时间点以水合氯醛深度麻醉，迅速断头取脑，切取含血肿的脑组织片（约5 mm），立即放入10%甲醛液中，固定24h后经乙醇梯度脱水，二甲苯透明，浸蜡，包埋，切片（5μm），HE染色，封片。光镜观察病变区及附近脑组织病理改变。

3 统计学处理

各组测定值用均数±标准差（x±SD）表示，用SPSS统计软件作单因素方差分析（one-way ANOVA），显著性水平p

4 结果

4.1 Sivelestat对ICH大鼠神经病学评分的影响 假手术组各时间点神经功能缺损评分均为0分；ICH大鼠麻醉清醒后立即评分均为3分或4分；随着时间的推移，ICH大鼠神经功能评分逐渐下降，且给药组评分的下降快于模型组。在ICH后12h、24h, Sivelestat大、中剂量治疗组和Nimodipine治疗组与模型组相应时点的神经缺损评分比有差异（p

4.2 Sivelestat对大鼠脑出血后BWC的影响 大鼠脑出血后其脑含水量随着时间的推移不断增加, 各组与假手术组比在各个时点明显上升。治疗组ICH大鼠脑含水量与模型组比，各个时点均不同程度降低。其中， Sivelestat大、中剂量治疗组和Nimodipine治疗组与模型组在四个相应时点比较其脑含水量降低程度明显（p

4.3 Sivelestat对大鼠脑出血后脑EB含量的影响 各组ICH大鼠的EB含量明显高于假手术对照组；而与模型组比较， Sivelestat大、中剂量治疗组在8、12、24小时时间点使EB含量明显降低（p

4.4 Sivelestat对大鼠脑出血病理形态的影响 ICH后大鼠脑组织出现明显的病理改变, 4h、8h、12h小时的切片可见到明显的出血灶,病灶周围组织疏松水肿，伴有少许炎症细胞浸润； 24h的切片可见到病灶周围组织仍然疏松水肿，炎症细胞浸润更为严重；而预先给予Sivelestat和尼莫地平治疗，ICH大鼠脑组织水肿和炎症细胞浸润不同程度减轻(见照片1～4)。

5 讨论

ICH病理机制极其复杂，涉及的病理过程颇多，除了血肿本身的占位性损害外，尚有周围脑组织血液循环障碍、局部脑血流量的下降、代谢紊乱、炎症反应等因素导致的周围细胞损伤和脑水肿，造成神经功能的缺损［6~9］。在ICH后继发性脑损伤的研究中，脑水肿的作用受到广泛关注：脑水肿即是颅内压增高的主要原因，也是ICH继发病理生理变化的主要因素［10］，因此，测定脑水肿可在一定程度上反映ICH的严重程度和药物的治疗效果；而脑出血后脑水肿的形成主要与血肿周围缺血、凝血过程产生的各种酶、血肿本身释放的各种生化物质、血脑屏障的通透性增高有关。

此前，Akira等［11］观察到西维来司钠对缺血/再灌注大鼠模型的神经损伤具有保护作用；与此相似，我们的实验结果发现，西维来司钠能降低大鼠ICH后神经功能缺损评分、降低脑含水量、减少EB含量并改善脑组织细胞病理改变，表明西维来司钠对ICH具有保护作用，并且可能是通过减轻脑组织细胞的损伤、降低血脑屏障的通透性从而减轻脑水肿来发挥这一作用。本实验结果虽然显现出西维来司钠对ICH有一定的临床应用前景，但其确切机制仍需进一步探讨。

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