HPLC法测定亚贡叶中绿原酸的含量
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摘 要：目的：建立亚贡叶中绿原酸的含量测定方法。方法：采用高效液相色谱法测定亚贡叶中绿原酸的含量。色谱柱：Agilent Zorbax-C18(250mm×4.6mm，5μm)，流动相：乙腈～0.4%磷酸(10：90)，流速为1.0mL/min，检测波长：327nm，柱温为25℃。结果：绿原酸含量的线性范围为0.39～1.93μg，r=0.9992，加样回收率为97.5%，RSD为2.0%。结论：测定方法简便、准确、重现性好，适用于亚贡叶的质量控制。
关键词：亚贡叶；hplc法；绿原酸
中图分类号：R285.5
文献标识码：A
文章编号：1673-7717(2008)03-0580-02
The Content Determination of the Content Chlorogenic Acid in Smallanthus Sonchifolius by HPLC
WEI Qing-rong，DOU De-qiang，TIAN Fang，KANG Ting-guo
(College of Pharmacy，Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Dalian 116600，Liaoning China)
Abstract：Objective：To establish an analytical method for determinating chlorogenic acid in Smallanthus sonchifolius. Methods：The determination was measured by HPLC with Agilent Zorbax-C18(250mm×4.6mm，5μm) column，using acetonitrile-0.4% H3PO4(10：90) as mobile phase. The flow rate was 1mL/min，detection wave length was 327nm and column temperature is 25℃. Results：These was a good linear relationship with a range of 0.39～1.93μg for chlorogenic acid，r=0.9992. The average recovery rate for chlorogenic acid was 97.65%，RSD=2.0%. Conclution：The method was accurate，rapid and simple for quantitative analysis of Smallanthus sonchifolius.
Keywords：Smallanthus sonchifolius；HPLC method；chlorogenic acid
亚贡Smallanthus sonchifolius(Poepp.et End1.)H.Robinson为菊科多年生草本植物，俗称雪莲果、雅龙果，英文名为“YACON”。原产于南美洲安第斯山脉，主要生长在秘鲁海拔2800米以上的安第斯高原地区[1]。亚贡根茎至今已有500余年的食用历史，是当地印第安人的传统根茎食品，被认为是可缓解糖尿病、肠道功能紊乱等多种慢性病的南美药食两用植物之一[2]。民间用亚贡叶加工成茶，冲泡饮用，有降血糖、预防动脉粥样硬化的功效[3]。在我国海南、台湾、云南、江苏等地有少量种植[1]。绿原酸是亚贡叶的活性成分之一[1]。本文以绿原酸为含量测定指标，对产于辽宁省鞍山的亚贡叶中绿原酸进行含量测定，为其资源合理的开发利用及质量控制提供理论依据。
1仪器与试药
1.1仪器 LC-2010c型高效液相色谱仪(LCSOLUTION工作站，日本岛津公司)；BT224S型电子天平。
1.2试药 液相用乙腈、甲醇为色谱纯，购于天津优尼莱博化学试剂有限公司、天津四友化学试剂有限公司，磷酸为分析纯，水为蒸馏水。样品制备用甲醇为分析纯，购于各试剂公司。绿原酸购于中国生物制品检定所(批号0753-2001110)，亚贡叶采自辽宁岫岩。
2实验方法与结果
2.1色谱条件 色谱柱：Agilent Zorbax-C18(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈-0.4%磷酸(10∶90)流速1.0mL/min，理论板数以绿原酸计算为2000。外标法定量，进样量20μL，检测波长：327nm，柱温25℃。
2.2对照品溶液的制备 精密称取五氧化二磷减压干燥12h的绿原酸对照品加50%甲醇制成96.25μg/mg的绿原酸对照品贮备液。
2.3供试品溶液的制备 取亚贡叶研细，过三号筛，取细粉1g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入50%甲醇50mL，称定重量，回流提取2h，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足损失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5mL，置10mL量瓶中，加50%甲醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，作为供试品溶液。
2.4测定方法 精密吸取绿原酸对照品溶液10uL，供试品溶液20uL，注入液相色谱仪，测定，即得。结果见图1～2。
2.5样品提取条件的选择 药典中测定绿原酸含量金银花采用50%甲醇超声提取30min[4]，用甲醇回流2h[4]。对同一批药材，对该两法用不同溶剂、不同时间作了比较。见图3～7、表1。
表1中结果可见，用50%甲醇回流提取2h效率最高。
2.6线性关系考察 精密量取对照品溶液4、8、12、16、20μL注入液相色谱仪，测得峰面积，以浓度(μg/mL)为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，其回归方程y=2226.1x-10.429，r=0.9992，结果表明绿原酸在0.39～1.93μg/mL的浓度范围内线性关系良好。
2.7精密度试验 取亚贡叶粉末1g，精密称定，按上述方法制成供试品溶液，进样量20μL，连续进样5次，测定峰面积为118340、119456、117976、120553、117864，RSD为1.0%。
2.8重现性实验 取亚贡叶粉末1g，共5份，精密称定，按上述方法制备供试品溶液，进样量20μL，测定峰面积为118340、121556、117832、116441、120764，RSD为1.8%。说明本方法重现性良好。
2.9稳定性实验 取亚贡叶粉末1g，共5份，精密称定，按上述方法制成供试品溶液，分别于0、1、2、4、6、8、10h注入高效液相色谱仪进行测定，峰面积RSD为2.0%，说明绿原酸在10h内基本稳定。
2.10回收率实验 采用加样回收法。精密称取已知含量的供试品5g，共取6份，精密加入50%甲醇50mL，再分别添加1.010mg绿原酸对照品。依法测定其含量。结果见表2。
3 讨 论
3.1波长的选择 将绿原酸用50%甲醇溶解，在200～400nm进行紫外扫描，得入max=327.5nm，所以波长为327nm。
3.2色谱柱的选择 试用过不同品牌15、20和25cm的色谱柱。发现Agilent Technologies 25cm柱效果最好。
3.3流动相的选择 试用过甲醇-磷酸，乙腈-醋酸，乙腈-磷酸不同比例的流动相，发现乙腈-磷酸(10∶90)效果最佳。
3.4水分的测定 用烘干法测定样品的水分为8.5%，含量测定应以除去水分的干燥品计算。
参考文献
[1] 金文闻，余龙江，孟思进，等.亚贡的植物学及其药理作用研究概况[J].中草药，2006，37(4)：633-636.
[2]Valentová K，Ulrichová J.Smallanthus sonchifolius and L ep-idium m eyenii-prospective A ndean crops for the prevention of chronic diseases[J].Biomed Papers，2003，147(2)：119-130.
[3]Valentová K，Cvak L，Muck A，et al. Antioxidant activity of extracts from the leaves of Smallanthus sonchifolius[J].European Journal of Nutrition，2003，42(1)：61-66.
[4]国家药典委员会.中华人民共和国药典2005年版(一部)[S].北京：化学工业出版社，2005：152.