人工培养北虫草子座和培养基中多糖和核苷类成分的含量分析
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摘要：目的建立分析北虫草中多糖和核苷类成分含量的方法，并对比分析北虫草子座和培养基中的成分。方法 用硫酸-苯酚法测定北虫草中多糖含量；用RP-HPLC法同时测定北虫草中尿苷、腺苷和虫草素含量。结果北虫草子座中多糖含量分别为4.67 ％和4.34 ％，培养基中为3.42 ％。北虫草2006年样品与2007年样品比较，尿苷（0.267 % vs 0.063 %）、腺苷（0.247 % vs 0.082 %）和虫草素（0.054 % vs 0.166 %）含量均有显著差异，2007年样品子座与培养基相比，尿苷（0.063 % vs 0.052 %）和腺苷（0.082 % vs 0.117 %）含量无显著差异，培养基中虫草素含量（0.318 %）显著高于子座（0.166 %）。结论建立了北虫草多糖和核苷类成分定量分析方法。该方法简便、可靠，可准确测定北虫草中多糖和3种核苷类成分的含量。
关键词：北虫草；多糖；尿苷；腺苷；虫草素
中图分类号：R282.71文献标识码：A文章编号：1672-979X(2009)01-0045-03
Content Analysis of Polysaccharides and Nucleosides in Stroma of Cultured Cordyceps militaris and Culture Medium
SHI Min, ZHAO Yu, WEN Xue-sen*
(School of Pharmaceutical Sciences，Shandong University，Jinan 250012, China)
Abstract：Objective To establish methods to determine the contents of polysaccharides and nucleosides in Cordyceps militaris and to compare the contents of them in the stroma and culture medium. Methods The contents of polysaccharides in Cordyceps militaris were determined by phenol-sulfuric acid method. The contents of uridine, adenosine and cordycepin were simultaneously determined by RP-HPLC method. Results The contents of polysaccharides in the stroma of Cordyceps militaris were 4.67 % and 4.34 %, while 3.42 % in the culture medium. Comparing the sample of Cordyceps militaris obtained in 2006 with that in 2007, there were large differences in the contents of uridine（0.267 % vs 0.063 %）, adenosine（0.247 % vs 0.082 %） and cordycepin（0.054 % vs 0.166 %）. In the stroma and culture medium of the sample obtained in 2007, the contents of uridine and adenosine were 0.063 % and 0.052 %, 0.082 % and 0.117 %, respectively, which showed no obvious differences. But the content of cordycepin in the culture medium was 0.318%, which was much higher than 0.166 % in the stroma. Conclusion The quantitative analysis methods can be obtained for the determination of polysaccharides and nucleosides in Cordyceps militaris. And these methods are convenient and reliable for the accurate determination of polysaccharides and three kinds of nucleosides in Cordyceps militaris.
Key words：Cordyceps militaris; polysaccharides; uridine; adenosine; cordycepin
北虫草[Cordyceps militaris (L.) Link]又称蛹虫草、北冬虫夏草、蛹草，为冬虫夏草同属的真菌，它含有的药用成分与多种药效均与珍稀药材冬虫夏草相似[1]。由于冬虫夏草资源有限，价格昂贵，现已大规模人工栽培北虫草，用于医药和滋补保健品。北虫草中的多糖、尿苷、腺苷、虫草素等均为具有重要生理和药理作用的功能活性成分，我们用现代分析手段对其进行了测定与分析，为北虫草的质量控制提供了可靠且简便的方法；同时证明培养基所含的腺苷和尿苷含量与子座无明显差别，虫草素含量明显高于子座，可供在提取虫草素、开发虫草保健品中作为原料充分利用并发挥其价值。
1仪器与材料
1.1仪器
TU-1800型紫外可见分光光度计（北京普析通用）；AY120型电子分析天平（日本岛津）；SZ-1快速混匀器（金坛金城国胜实验仪器厂）；LC-10ATvp高效液相色谱仪（日本岛津），SPD-10Avp紫外检测器； N2000色谱工作站（浙大智达）。
1.2试药
北虫草样品由山东鲁山虫草研究所提供，大米培养基培养，分别是2006年和2007年的产品，经鉴定为Cordyceps militaris。尿苷、腺苷、虫草素对照品均购自中国药品生物制品检定所，批号分别为887-200202、879-200202、858-200202。葡萄糖对照品系上海国药集团产。色谱试剂均为色谱纯，超纯水，其他试剂为国产分析纯。
2方法与结果
2.1多糖含量测定
2.1.1虫草多糖的提取[2]将虫草样品干燥至恒重，粉碎，过65目筛，精密称定样品粉末1 g（培养基称取2 g）置于索氏提取器中，加入乙醚100 mL于圆底烧瓶中，回流提取至无色，挥干残留的乙醚。加入20倍蒸馏水回流提取，每次30 min，提取2次，减压过滤。合并两次滤液，浓缩至10 mL，加乙醇至醇含量为80 %。置于冰箱12 h，4 000 r/min离心10 min，去上清，沉淀物60 ℃干燥，以适量蒸馏水溶解，0.2 %活性炭脱色，定容至500 mL。
2.1.2标准曲线精密称取干燥至恒重的葡萄糖0.05 g，用蒸馏水溶解定容至100 mL，得浓度0.5 mg/mL的储备液。精密量取此溶液1.5，3.0，4.5，6.0，7.5，9.0 mL于25 mL量瓶中，定容，得浓度分别为0.03，0.06，0.09，0.12，0.15，0.18 mg/mL的标准溶液。
取标准溶液0.2 mL，加入5 ％苯酚溶液0.4 mL，浓硫酸2 mL，混匀，室温反应30 min。用蒸馏水0.2 mL，加5 ％苯酚0.4 mL，浓硫酸2 mL混匀为空白对照。于490 nm处测吸光度。得标准曲线为A=7.074 3C－0.088 8，r=0.999 6。
2.1.3样品测定取制备的样品溶液0.2 mL，加入5％苯酚溶液0.4 mL，浓硫酸2 mL，混匀，室温反应30 min。于490 nm处测吸光度。测得各样品多糖含量见表1。
2.2.1样品溶液制备将虫草样品干燥至恒重，粉碎，过65目筛，精密称定样品粉末0.25 g，置于25 mL量瓶中，用20 %甲醇定容，室温下超声提取40 min，放冷至室温，5 000 r/min离心10 min，经0.45 μm微孔滤膜过滤，取滤液，即得。
2.2.2色谱条件色谱柱为Phenomenex Luna 5 μ C18（250 mm×4.60 mm），流动相为甲醇-水10:90，等度洗脱，流速1 mL/min，检测波长260 nm，柱温25 ℃，进样量20 μL。
2.2.3标准曲线精密称定尿苷、腺苷、虫草素对照品各1.2 mg，用50 %甲醇溶解并定容至10 mL。各取上述对照品适量，等量混匀，稀释得不同浓度的标准溶液，注入高效液相色谱仪，见图1A。
以积分面积（Y）与浓度（C）进行回归，得3种核苷类化合物的标准曲线，尿苷Y=29 788 826.97C－25 798.756，r=0.999 3；腺苷Y=49 607 457.76C－49 618.865，r=0.999 4；虫草素Y＝61 480 076.24C－56 887.257，r=0.998 2。
2.2.4不同样品中核苷类成分含量的比较取样品1（2006年子座）、样品2（2007年子座）和2007年培养基分别按上述方法处理，进样20 μL测定含量。结果见表2。
3讨论
测定北虫草中多糖含量多用比色法，常采用硫酸-苯酚法、硫酸-蒽酮法[5]等。本文用硫酸-苯酚法测定了北虫草
子座和培养基中多糖的含量，测定中，以乙醚回流和活性炭吸附等方法，尽量去除色素等成分对吸光度的干扰，方法简便，线性好。测得2006年和2007年产北虫草样品多糖含量分别为4.67 ％和4.34 ％，无显著差异（P＞0.05），2007年培养基中多糖含量（3.42 %）则显著低于子座的多糖含量（P＜0.05）。
本文用HPLC法在等度洗脱同时测定了北虫草3种核苷类成分的含量，测得2006年样品尿苷和腺苷含量均显著高于2007年样品（P＜0.05），2006年样品的虫草素含量却显著低于2007年样品（P＜0.05），数值均相差3~4倍，表明人工培养的北虫草样品之间质量差异较大，这可能与培养方法、培养条件、生长周期长短等有关。参考中国药典（2005年版一部）对冬虫夏草的规定[6]，以腺苷计，2006年样品（0.247 %）和2007年样品（0.082 %）均符合药典要求（不少于0.010 %）。
本文还对比了人工培养北虫草子座和培养基各成分含量的差异，培养基中除尿苷含量略低外，腺苷和虫草素含量均高于子座，其中虫草素含量为子座的2倍，差异有统计学意义（P＜0.05），可从中提取虫草素或作为生产虫草类保健品的原料。
参考文献
[1]连云岚，杨中林. 北虫草化学成分及药理作用研究进展[J]. 山西医药杂志，2006，35（1）：44-46.
[2]刘春泉，李大婧，刘荣. 蒽酮-硫酸法测定北冬虫夏草多糖含量[J]. 江苏农业科学，2006，2：122-124.
[3]顾宇翔，王尊生，李素霞，等. HPLC分析虫草发酵制品中多种核苷及碱基[J]. 药物分析杂志，2006，26（7）：953-957.
[4]张振谦，马月飞，黄永春. 虫草中腺苷含量的快速测定[J]. 广西工学院学报，2007，18（3）：4-7.
[5]葛新，李云兰，白小红，等. 比色法测定人工虫草菌丝体多糖含量[J]. 山西医科大学学报，2001，32（5）：418-419.
[6]国家药典委员会. 冬虫夏草[S]//中国药典2005年版一部.