一种从废啤酒酵母中生产β―D―葡聚糖和甘露聚糖的新方法

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【摘 要】β-D-葡聚糖和甘露聚糖对于人类健康有许多有益的作用，酵母细胞壁是其重要来源。啤酒废酵母泥是酿酒酵母中RNA提取的主要副产物。本文研究出一种以废酵母浆为材料分离β-D-葡聚糖和甘露聚糖的新方法。经过超声波法和高温高压处理后，β-D-葡聚糖是先用碱萃取后用蛋白酶酶解，收率和纯度分别为16.73%和76.82%。甘露聚糖是通过透析制备，最终产量和纯度分别为9.79%和64.39%。

【关键词】β-D-葡聚糖；甘露聚糖；酿酒酵母；酵母细胞壁；盐度

【Abstract】The polysaccharides β-D-glucans and mannans show numerous beneficial effects for the health of humans and animals and the cell wall of Saccharomyces cerevisiae is an important source of β-D-glucans and mannans. Spent yeast slurry is the major by-product of the process of extracting RNA from Saccharomyces cerevisiae. We have developed a new method to isolate β-D-glucans and mannans with the material of spent yeast slurry. After sonication and high temperature and high pressure treatment， β-D-glucans were extracted firstly with alkali， then with protease， and then dried， with a yield of 16.73% and a purity of 76.82%. Mannans were prepared through the process of concentration， dialysis， precipitation and drying， with a finally yield and purity of 9.79% and 64.39%， respectively.

【Key words】β-D-glucans；Mannans；Saccharomyces cerevisiae；Yeast cell wall；Salinity

0 概述

酵母多糖是从酵母细胞壁中提取的大分子碳水化合物的聚合物，主要成分是β-D-葡聚糖和甘露聚糖。β-D-葡聚糖包括（1，3）β-D-葡聚糖与少量的（1，6）连接葡萄糖和其他支链[1]。甘露聚糖通常以共价键和蛋白质结合，称为甘露糖蛋白[2]。

β-D-葡聚糖通常称为生物反应调节剂（BRM）[3]。β-D-葡聚糖可以作为免疫应答，抗癌，造血调控，保肝，降低胆固醇以及降血糖活性[4， 5-8]。β-D-葡聚糖也有抗氧化的作用和能会加速伤口愈合的作用[9，10]。细胞壁甘露聚糖也有粘接性能[11]和抗原变异[12]。鉴于多糖以上所有的特性和用途，前人已有很多研究。但是大多数都是β-D-葡聚糖和甘露聚糖单独提取。我们提出了一个同时生产两种产品的新方法。这个方法过程简单，高效和易于转换到大规模生产。

生产过程见图1。

1 实验

1.1 实验材料

固体含量为25%废酵母泥：南京同凯兆业生物技术有限公司提供。酶：沈阳诺维信生物技术有限公司。试剂均为国产分析纯。

1.2 分析方法

1.2.1 多糖的含量测定

采用苯酚硫酸法-与6%的苯酚浓度测定，于490nm紫外吸收处测定总糖，分别用葡萄糖和甘露糖为标准曲线定量[13]。

1.2.2 蛋白质的测定

通过凯氏定氮分析仪测定总氮（福斯特卡托，公司，瑞典）根据AOAC正式方法。由总氮含量乘以6.25计算蛋白质含量。

1.2.3 灰分的测定

干燥后的样品在600℃焚烧炉中测定灰分（林德伯格/蓝色M，美国）[14]。

1.2.4 含盐量的测定

用硝酸银滴定法测定盐，用作指示剂铬酸钾。

1.2.5 红外光谱

β-D-葡聚糖和甘露聚糖红外光谱分析在Nicolet 380光谱仪中进行（热电，美国）。样品KBr压片近似重量比为1：100[15]。

1.3 过程

1.3.1 预处理

由于废啤酒酵母浆包含一些杂质和无机离子。预处理是用蒸馏水洗涤混合物（300g）在室温下以5000 rpm搅动两次，每次维持10分钟。每次洗涤后放置在温度4℃下冰箱中备用。

1.3.2 超声处理

预处理后的酵母细胞壁是加入0.02M柠檬酸盐缓冲液（添加碱调整到pH=7.2）得到的悬浮液中固体含量为15%。在室温下在超声波细胞破碎仪中（jy92 -ⅡDN 新芝生物科技有限公司，宁波）进行超声，程序设计为超声2s停2s持续10分钟。

1.3.3 高温高压提取

超声后将悬浮液放入压力为0.1MPa在高压蒸汽灭菌器中高压灭菌90min，温度为121℃后冷却到30℃。不溶性残留物通过离心分离，并将柠檬酸盐缓冲液与上清液（SUP）结合，存储在4℃下。沉积物（SED）被用来提取β-D-葡聚糖。

1.3.4 β-D-葡聚糖的提取

（1）碱处理。

通过正交法L9（34）优化提取条件。九种提取物分别在提取温度为50℃，55℃和60℃，提取时间分别为2h、3h、4h，固液比为1 / 3，1 / 4，1 / 5（W / V）和NaOH浓度为2%，3%，4%下进行。表1显示了实验条件为β-葡聚糖的提取啤酒废酵母泥300g，其中含有78.42%的水分。混合后冷却到室温，不溶性残留物在室温15min 5000rpm条件下被离心分离，用蒸馏水洗涤两次。丢弃上清液和收集沉淀物。

（2）蛋白酶处理

碱处理后用不同的酶酶解，目的是降低蛋白质含量和纯化多糖。用水稀释得到的悬浮液含有15%（W/W）的固体含量。分别用木瓜蛋白酶（P1），复合酶（P2）和中性蛋白酶（N）在各自的最佳条件酶解后，悬浮液5000rpm离心10min。丢弃上清液，收集湿产物。

（3）洗涤和干燥

湿β-D-葡聚糖悬浮在95%乙醇混悬液中搅拌3h，然后离心弃上清。用乙醇冲洗两遍，在60℃下干燥。

1.3.5 提取甘露聚糖

（1）浓度

在50℃-60℃下，在旋转蒸发器（re-52，中国上海中国生化仪器厂）超浓缩至原体积的1/2-1/3。完成后溶液冷却至室温。

（2）透析

在室温条件下，对蒸馏水透析适当时间后测定溶液盐度。

（3）脱水

浓缩的溶液滴加三倍体积的乙醇搅拌，然后储存在4℃下超过10h。

（4）洗涤和干燥

用乙醇沉淀数次直到上清液透明，甘露聚糖真空过滤，并在60℃下干燥。收集的甘露聚糖是白色无定形粉末。

2 结果与讨论

2.1 预处理

预处理会损失去一部分多糖，所以洗两次是最好的。通过物理或者化学的方法使完整的酵母通过自溶和渗透来提取酵母内容物[14]。葡聚糖和甘露聚糖产量如表2所示。

经过高温高压处理，将混合物离心。这个过程可以有效地分离甘露糖蛋白和葡聚糖。此外，高温高压处理能显著降低细胞壁[16]的机械强度，这可能有助于下酶解。

表2 分别处理葡聚糖和甘露聚糖中固体含量和化学成分

Mannans-1 meant the SUP， the sample precipitated from， without dialysis.

Mannans-2 meant the sample was precipitated from the dialysis SUP.

a- refering to the weight of the starting material.

b-determination after acid hydrolysis of β-D-glucans and mannans.

c- calculation by total N*6.25.

2.2 β-D-葡聚糖的分离

2.2.1 碱处理

工艺中氢氧化钠可以去除一些不需要的成分如蛋白质，脂类和多糖。温度，提取时间，料液比、NaOH浓度通常被认为是最重要的因素。优化的β-D-葡聚糖提取合适的提取条件可通过正交实验实现。表3显示了实验条件对碱提取结果的影响。因此，表4列出了K，k、R值。

KiA=∑ the amount of target compounds at Ai.

kiA=KiA/3.

RiA=max{kiA}-min{kiA}.

根据表4中R的数值，以碳水化合物及粗蛋白平均百分比的影响分别是：B>A>D>C，A>D>C>B。由于蒸馏水相对便宜，所以增加料液比有助于去除其他杂质，因此，我们选择C2为适用条件。NaOH浓度（因子）的确定的粗蛋白含量和高浓度碱易造成多糖[17-20]降解，因此适用条件是D2。对于葡聚糖提取过程的最优参数组合为A3 B2 C2 D2。即，提取温度，提取时间，料液比、NaOH浓度分别为60℃，3h，1/4，和3%。

2.3 甘露聚糖提取

2.3.1 浓度与透析

上清液（SUP）经过高温高压处理后收集，在旋转蒸发器浓缩。由于SUP含有大量的盐，如果超浓缩过度，盐从溶液中析出，造成多糖的损失，因此，2-3倍是适当的浓度。

经过蒸馏水透析一段时间，盐从溶液中渗透到蒸馏水中。以碳水化合物和灰分的含量为评价指标。溶液盐度和其中碳水化合物和灰分含量的产品之间的关系如图2所示。

根据分析，随着盐度的降低，碳水化合物和蛋白质都相应增加，灰分减少，即在产品中的活性成分增加。如图所示，灰分随着盐度的变化不断减少。但是，盐度的变化从1.81%到0.06%， 9h内灰分下降仅为0.17%，不利于工业化发展。因此，溶液的适宜盐度为0.8%～1.2%。

2.4 产物定性

2.4.1 红外检测

在3384cm-1/3397cm-1，2932cm-1/2922cm-1，1644cm-1/1637cm-1处有明显的吸收带，分别是-OH，C-H键和C=O拉伸吸收峰。在1200cm-1-950cm-1的是C-O振动吸收峰。最重要的约891cm-1处的吸收带说明葡聚糖是β-构型， 845cm-1处是α-吡喃环[21]端基异构体形式。在811cm-1和912cm-1处的特殊吸收说明M是α-甘露聚糖[22]，这从他们的单体单元和葡聚糖的特征谱带在1157cm-1，1078cm-1，1040和891cm-1处，这表明链接为β构型。因此，说明产物是β-D-葡聚糖和α-甘露聚糖。如图3所示。

3 结论

新方法在超声处理后采用高温高压法分离β-D-葡聚糖和甘露聚糖。β-D-葡聚糖通过碱处理和蛋白酶降解法纯化，而甘露聚糖的制备则通过以下步骤包括浓缩、透析、沉降制备。此外，还验证了浓缩液盐度和多糖、灰分和沉降速率的关系，最终确定了整个工艺的最优盐度。

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