肾康冲剂联合厄贝沙坦对单侧输尿管梗阻肾间质纤维化的影响

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【摘 要】目的：观察肾康冲剂联合厄贝沙坦对肾间质纤维化的防治作用及其效果。方法：75只雄性清洁级（Sprague　Dawley　SD）大鼠，用单侧输尿管梗阻（Unilateral　Ureteral　Obstruction UUO）模型，随机分为五组：假手术组、模型组、厄贝沙坦组、肾康冲剂组、厄贝沙坦联合肾康冲剂组，每组15只。治疗组分别给予肾康冲剂（300mg，kg-1，d-1）、厄贝沙坦粉末（10mg，kg-1，d-1）、及二者联合灌胃治疗。假手术组及模型组予相应量生理盐水灌胃治疗。于给药后第3，7，14d分别观察梗阻侧肾组织病理学的改变及测定肾组织中TGF-β1、NF-KB、α-SMA的表达、肾组织胶原蛋白（ug）／肾重（）之比。结果：与假手术组相比，模型组中肾间质水肿，单个核细胞浸润，肾间质纤维组织相对面积显著扩大，TGF-β1、NF-　?B、α-SMA的表达及肾组织中胶原蛋白含量表达明显上调（P

【关键词】肾康冲剂；病理学改变；防治；肾间质纤维化

【中图分类号】R693；R692.9 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2013）01-0092-02

肾间质纤维化（renal　Interstitial　fibrosis，RIF）的程度与肾脏疾病慢性进展速度和患者预后密切相关。为了进一步明确肾康冲剂对RIF的防治作用及其效果，本文进行了以下研究。

1　材料与方法

1.1　单侧输尿管梗阻模型的建立与分组：①模型建立：雄性SD大鼠共75只（河北医科大学动物实验中心提供合格证号：DK04O4-0036，DK0405-002），体重180-220克，模型组和治疗组按左侧输尿管结扎术，建立大鼠肾间质纤维化的模型[1]。假手术组开腹后，只游离左侧肾脏及输尿管，但不结扎，其余步骤同模型组。5组动物分别于术后第3、7、14天各取5只处死取左肾；②分组：75只清洁级大鼠，用单侧输尿管梗阻（UUO）模型，随机分为五组：A假手术组、B模型组、C厄贝沙坦组、D肾康冲剂组、E厄贝沙坦加肾康冲剂组，每组15只，治疗组在单侧输尿管结扎（UUO）基础上给予肾康冲剂（300mg，kg-1，d-1）　厄贝沙坦粉末（10mg，kg-1，d-1）灌胃治疗，每天一次；模型组在UUO基础上给予生理盐水灌胃治疗，对照组不结扎输尿管外，其余同模型组。

1.2　主要试剂：：肾康冲剂　（西安国泰药业有限公司生产。批号：011001）；）兔抗大鼠TGF-β1 多克隆抗体、兔抗人NF-KBP65多克隆抗体和小鼠抗大鼠平滑肌肌动蛋白均购于santa　crul　，羊抗免IgG购于北京中山公司，SP试剂盒购于北京中山公司。

1.3　实验方法

1.3.1　肾组织病理学观察：取FAA固定的肾组织，酒精梯度脱水，石蜡包埋，制成2um厚石蜡切片，行HE及Masson染色，观察肾间质病变情况，肾小管间质损害程度按Mezzano方法进行分级。

1.3.2　免疫组织化学染色：NF-　?B，TGF-β1　，α-SMA，均采用SP法，取4um厚的10％中尔马林固定，石蜡切片，常规脱蜡，浸入3％H2O25min（去除内源性过氧化氢酶活性）。PBS缓冲液（PH＝7.4）冲洗3次，每次5分钟。正常山羊血清封闭。滴加稀释的一抗（NF-?B，TGF-β1，α-SMA均为1：100稀释液）。滴加适量抗体山羊抗免IgG。滴加SP试剂，PBS洗3次。DAB显色，苏木素复染3分钟。脱水，透明封片。镜检肾实质及间质细胞浆内棕褐色颗粒为阳性。

1.3.3　肾组织半定量分析：选择DAB染色阳性的石蜡切片进行病理图象分析：在200倍高倍镜下，每张切片任意选取5个不含肾小球的肾皮质视野，采用IMS-2000病理图象分析系统软件（华中理工大学自动研究所）计算每个视野的阳性面积占该视野面积的比值，然后取其平均值作为该切片的阳性面积比率，用%表示。

1.3.4　肾间质胶原蛋白含量的测定：肾间质胶原蛋白含量的测定，即氯胺T法，用紫外可见分光光度计560nm波长下比色，根据羟脯氨酸含量换算出肾组织胶原蛋白含量，并计算出胶原（ug）/肾重mg）之比。

2　结果

肾组织病理学改变光镜下通过HE、Masson染色观察假手术组从第3天至第14天肾组织病理未见明显改变。模型组光镜下术后第3天开始出现肾间质水肿，单核细胞浸润。术后第7天肾小管明显扩张，肾间质大量局灶炎性细胞浸润，管腔内可见脱落上皮细胞，术后第14天梗阻侧肾脏肉眼观察肾脏体积增大，颜色变灰白，肾皮质变薄，肾小管上皮细胞弥漫空泡变性，多数肾小管扩张，肾间质弥漫的单核、淋巴细胞浸润伴间质纤维化，Masson染色可见皮质外髓萎缩肾小管较多，纤维化较明显，偶见肾小球硬化。各治疗组（厄贝沙坦组、肾康冲剂组、厄贝沙坦加肾康冲剂联合组）大鼠从第3天肾小管间质病变与模型组无明显改变，随着用药时间延长到14天，与B模型组同期比较间质纤维化程度减轻，炎性细胞浸润减少，间质纤维化减轻，厄贝沙坦加肾康冲剂联合组比厄贝沙坦组、肾康冲剂组变化明显，而厄贝沙坦组、肾康冲剂组病理改变无明显差别。

3　讨论

肾间质纤维化是各种肾脏疾病进展成为终末期肾功能衰竭重要病理基础，由于各种原因引起间质炎性细胞浸润，肾间质细胞增生并产生各种炎症介质，使细胞外基质（ECM）过度沉积于肾小管间质，最终导致纤维组织过度增生。PIF的早期主要表现为细胞损伤和激活等炎症反应；肾小管上皮细胞增生，变性，间质炎性细胞浸润和间质水肿[2]，晚期主要表现为肾小管萎缩，间质成纤维细胞增生以及间质纤维化。本研究利用经典的UUO肾间质纤维化动物模型，同样证实了以上组织形态学变化规律，肾康冲剂治疗组虽然也同样出现明显肾小管损伤、间质纤维化等与模型组相同的组织形态学改变，但肾小管损伤程度、间质炎症细胞浸润数量以及肾间质纤维化指标，均较模型组明显减轻。说明肾康冲剂具有较好的预防肾间质纤维化的作用，本实验中用血管紧张素受体拮抗剂厄贝沙坦下调NF-?B和TGF-β1的表达，抑制ACE使AngⅡ生成减少。用厄贝沙坦和肾康冲剂治疗后肾间质中NF-?B、TGF-β1、α-SMA的表达下调，肾间质胶原蛋白的合成减少，对肾间质纤维化有明显的保护作用，同时我们发现中药肾康冲剂与厄贝沙坦有相同的作用，并在减低NF-?B的表达方面优于厄贝沙坦。

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作者简介：

郝玉杰，男，37岁，医学博士，主任医师，河北省迁安市人民医院副院长，研究方向：肾脏病的临床诊疗。