壳寡糖与双歧杆菌对肿瘤协同抑制的实验研究

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罗晓庆　钱丽丽　李殿俊　曲丽娟

摘　要：目的：观察壳寡糖协同双歧杆菌对肿瘤抑制作用的影响。方法：采用体内注射的方法将壳寡糖和双歧杆菌注入荷瘤小鼠体内，观察肿瘤生长情况及MTT比色法观察壳寡糖对肿瘤细胞的体外抑制作用。结果：壳寡糖协同双歧杆菌对肿瘤的生长有抑制作用，显微镜观察显示肿瘤组织出现坏死；壳寡糖对肿瘤细胞生长有抑制作用，其抑瘤率与浓度有关，与时间无关，肿瘤细胞经壳寡糖作用后，透射电镜显示细胞有凋亡趋势。结论：壳寡糖协同双歧杆菌可抑制肿瘤生长，同时壳寡糖可能诱导肿瘤细胞凋亡。

关键词：壳寡糖；双歧杆菌；肿瘤；抑制

壳寡糖为壳聚糖的降解物，壳聚糖是甲壳质的脱乙酰化物，甲壳质是虾、蟹等甲壳类、甲虫等的外骨骼及蘑菇等菌类的细胞壁成分，广泛存在于自然界的天然高分子物质，甲壳质和壳聚糖具有广泛的生物学作用，特别是提高机体的免疫功能、抗肿瘤、抗感染等作用，但由于它们不溶于水，其开发利用受到了很大程度的限制，而壳寡糖为壳聚糖的降解物，具有良好的水溶性，易被分散和吸收，而且具有多种生物功能，如作为植物功能调节剂，刺激植物生长，增强植物对病虫害的防御能力。改善动物肠道微生物的区系分布，刺激有益菌的生长，同时它能提高机体的免疫功能和抗癌能力。

双歧杆菌是人类肠道的正常菌群，在体内发挥着生物学屏障作用，除了抗感染、抗突变、促进消化、调节代谢、延缓衰老、抗肠道感染以及控制内毒素血症外，还具有抗移植肿瘤及提高宿主免疫功能的作用。

目前，国内对双歧杆菌抗肿瘤作用的研究开展的很深入，但对壳寡糖抗肿瘤方面的研究报道很少，尤其对二者共同抑瘤作用的研究还未见报道。

1 实验材料

1．1 实验对象

昆明小鼠(哈尔滨医科大学第三临床医院提供)，Hu-人肝癌细胞(哈尔滨医科大学免疫教研室提供)，LH-7人肺癌细胞(哈尔滨医科大学免疫教研室提供)。

1．2药品与试剂

壳寡糖(哈尔滨工业大学提供)，双歧杆菌(哈尔滨工业大学提供)。试剂：小牛血清，1640培养液，四甲基偶氮唑蓝(MIT)，二甲基亚砜(DMSO)。

1．3仪器与器材

倒置显微镜，酶标仪，96孔培养板，超净工作台，二氧化碳孵箱等。

2 方法

2．1体内实验

将120只昆明小鼠随机分为两大组。

2．1．1移植性腹水瘤60只小鼠随机分为6组，每组10只。分别为：双歧杆菌组；壳寡糖小剂量组(0.5％)；壳寡糖大剂量组(1.5％)；壳寡糖小剂量(0.5％)+双歧杆菌组(剂量各半)；壳寡糖大剂量(1.5％)+双歧杆菌组(剂量各半)；对照组(生理盐水)；试验第1天，各组小鼠腹腔种植H22肝癌细胞(1×108/mL)，以后每天向各组小鼠腹腔注射0.2mL的药物或生理盐水。7天后小鼠脱颈处死，无菌取腹水，据腹水量计算抑瘤率。

2．1．2移植性实体瘤分组方法同2．1．1。实验第1-7天各组小鼠腹腔注射药物或生理盐水0.2mL,第8天各组小鼠背部皮下种瘤，同时腹腔继续给药至试验第10天后，小鼠处死剥瘤称重，计算抑瘤率。取实体瘤标本做病理观察。

2．2体外实验

2．2．1 细胞培养L-H7肺癌细胞培养于RPMI-1640培养液(含10％小牛血清)中，在含5％C02的37℃孵箱中培养。细胞呈现贴壁状态，每3天传1代。实验用处于对数生长期的细胞。

2．2．2 MTr法测定壳寡糖对LH-7肺癌细胞杀伤活性调整对数生长期、状态良好的LH-7肺癌细胞数1×104/mL，100μL接种于96孔培养板中。5％C02，37℃孵箱中24h，稳定后，试验组每孔加入壳寡糖80μL，浓度分别为2000、1000、500、250、50mg/mL，均设4个复孔，并且设空白对照，对照组不加壳寡糖，空白组只加培养液。分别作用12、24、48、72h后加入5mg/mL的MIT20μL，孵育4h(细胞在SDH作用下将黄色MTr还原成紫蓝色结晶)后小心弃去上清，加DMS0150μL，振荡(10-20min)均匀，于酶标仪490nm波长处读OD值，重复2次，并计算抑瘤率。细胞生长抑瘤率=(1-实验组OD值/对照组OD值)×100％。将细胞用戊二醛固定，做电镜观察。

2．2．3透射电子显微镜观察细胞形态学的变化收集各组细胞，用PBS洗过的药物作用48h的LH-7细胞约5×10 6个，置于装有2mL完全培养基的Ependoff管中，1500r/min离心5min，弃去上清，加入2％戊二醛充分吹打细胞，离心，弃去戊二醛，再次加入2mL2％戊二醛固定过夜；1％饿酸固定1h，离心弃去上清，蒸馏水洗2次。2％醋酸铀预染1h，离心弃去上清，蒸馏水洗2次。依次过丙酮逐级脱水，每次5min，树脂包埋，超薄切片，柠檬酸铅染色及电子显微镜观察细胞的形态变化，并拍片。

2．3 统计学方法

所有计量数据应用SPSSl0.0统计软件进行统计分析。

3 结果

3．1体内实验

3．1．1移植性腹水瘤组押瘤率抑瘤率=(对照组腹水量一实验组腹水量)/对照组腹水量×100％；双歧杆菌、壳寡糖(1.5％)、双歧杆菌+壳寡糖(1.5％)、双歧杆菌+壳寡糖(0.5％)均明显抑制H笠腹水瘤的生长，但双歧杆菌+壳寡糖(1.5％)抑瘤率最高，达67.21％。

3．1．2移植性实体瘤组抑瘤率抑瘤率=(对照组瘤重一实验组瘤重)/对照组瘤重×100％；双歧杆菌、壳寡糖(1.5％)、双歧杆菌+壳寡糖(1.5％)、双歧杆菌+壳寡糖(0.5％)均明显抑制实体瘤的生长(P＜0.05)，双歧杆菌+壳寡糖(1.5％)抑瘤率达60.45％。阴性对照组平均瘤重>1g，说明造模成功，肿瘤的生长良好。

3．1．3移植性实体瘤组瘤组织形态学观察肉眼观察：H22实体瘤对照组肿块呈结节状，无胞膜，肿瘤多为浸润性生长，切面呈灰白色，中央常见大小不等的黄色坏死灶。而双歧杆菌+壳寡糖大剂量组肿块小，质韧，有部分小鼠肿瘤消退或未生长，瘤体大体外观苍白，与周围组织无粘连，无水肿现象，易于剥离。镜下瘤细胞形态学表现如下。对照组：大量H22肿瘤细胞排列呈巢状或索条状，血管丰富(似肝血窦)，肿瘤细胞大小不一，形态各异，细胞呈圆形或多边形，胞浆嗜碱性，核质比增大、核仁明显；壳寡糖大浓度(1.5％)组：瘤细胞形态学表现为大部分肿瘤细胞发生坏死，仅见个别残存的肿瘤细胞；双歧杆菌+壳寡糖大浓度(1.5％)组：瘤细胞形态学表现为大片坏死，偶见个别残存

的肿瘤细胞。

3．2体外实验

3．2．1抑瘤率抑瘤率=(1-实验组OD/对照组OD)×100％。表3结果在时间上进行统计学比较分析，应用t检验，得出结果皆为P＞0.05，说明壳寡糖对人LH-7肺癌细胞抑制与时间无关；随着浓度升高肿瘤细胞增殖抑制率增高，各剂量组均为P＜0.05，但浓度达2000mg/L时抑制率呈下降趋势。

3．2．2 形态学观察壳寡糖浓度为1000mg/L时人LH-7肺癌细胞电镜下形态变化(×6000)为瘤细胞体积变小，表面微绒毛变成质膜叶片，胞质浓缩，细胞器变致密，线粒体肿胀，大小不均，嵴残缺或消失，胞质内多见空泡样改变，核染色质边聚，核仁裂解，呈现出瘤细胞凋亡早期形态特点。

4 讨论

本实验所用的壳寡糖又称几丁质糖，具备水溶性好、生物活性高、功能作用大、应用领域广、易被人体吸收等突出特点，在医药、功能性食品、日化、农业等领域应用广泛。1990年，Ouehi-T等研究发现3个壳寡糖通过六亚甲基空间通道与5一氟脲嘧啶(5-FU)共轭结合后，其抗肿瘤作用强于5-FU；并把该复合物注入B338淋巴细胞白血病小鼠的腹腔中，小鼠的生存时间延长；通过皮下注射应用于MeTH-A纤维肉瘤或MH134肝细胞癌小鼠，发现产生对肿瘤的生长抑制作用。王中和等用低分子壳多糖口服液对临床患者进行辅助治疗，结果发现白细胞、淋巴细胞的总数保持稳定，T淋巴细胞的数量显著上升，说明低分子壳多糖能调整机体免疫机能，减少放疗对患者免疫功能的影响，有较好的抗肿瘤辅助疗效。而这些免疫指标的研究再一次表明，其作用机理与细胞免疫密切相关。2002年，杜昱光证明壳寡糖对肿瘤细胞的抑制作用与浓度有关，且随浓度增加抑制率上升。

目前认为双歧杆菌主要是通过调整和激活机体的免疫系统来发挥其抗肿瘤作用。由于该菌为生理性细菌，对宿主无致病性，所以它较目前已在临床上广泛应用的其它非特异性生物反应调节剂如OK432、卡介苗等更具有优越性。 壳寡糖是BF(双歧杆菌促生长因子)的一种重要种类，它能调节动物肠道内微生物的代谢活动，改善肠道微生物区系分布，促进双歧杆菌生长繁殖，从而提高机体免疫力，使肠道内PH下降，抑制肠道有害菌生长，产生B族维．生素，分解致癌物质，促进肠蠕动，增进蛋白质吸收。 本实验研究结果表明壳寡糖大浓度组对荷瘤小鼠腹水瘤和实体瘤均有抑制作用，小浓度组抑制作用不明显，双歧杆菌组、双歧杆菌+壳寡糖(小)、双歧杆菌+壳寡糖(大)实验组对小鼠腹水瘤和实体瘤组均有抑制作用，壳寡糖(大剂量)和双歧杆菌对肿瘤的抑制起到一定作用，且二者同时应用，有增强各自抑瘤效果的作用。实体瘤组，病理结果显示壳寡糖小浓度和大浓度组均有细胞坏死，但大浓度组坏死明显，双歧杆菌组、双歧杆菌+壳寡糖(小)、双歧杆菌+壳寡糖(大)实验组肿瘤细胞坏死明显。体外细胞培养结果显示随着壳寡糖浓度升高细胞增殖抑制率升高，但浓度达2000me/L时抑制率呈下降趋势，抑制率与作用时间无关；壳寡糖浓度为1000mg/L时人LH-7肺癌细胞电镜下形态变化(x6000)为瘤细胞体积变小，表面微绒毛变成质膜叶片，胞质浓缩，细胞器变致密，线粒体肿胀，大小不均，嵴残缺或消失，胞质内多见空泡样改变，核染色质边聚，核仁裂解，呈现出瘤细胞凋亡早期形态特点。因此，该实验结果为适当浓度的壳寡糖可抑制肿瘤生长，双歧杆菌与壳寡糖有协同抑瘤作用，同时壳寡糖可能诱导肿瘤细胞凋亡。

目前，国内对于双歧杆菌抗肿瘤的报道很多，对于壳寡糖抗肿瘤作用的报道相对较少，而二者同时应用的报道尚未见报道。本实验仅对壳寡糖和双歧杆菌抗肿瘤作用做了初期的研究，二者协同作用免疫机制有待今后继续实验研究。