猪卵巢采集月份、保存温度及时间对其卵母细胞体外成熟的影响

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摘要：为了探讨猪卵巢采集月份、保存温度及保存时间对卵母细胞体外成熟的影响，对不同月份、不同保存温度及不同保存时间的猪卵巢采用抽吸法获得卵丘卵母细胞复合体（COCs），体外培养统计其第一极体排出情况。结果表明，从屠宰场所取卵巢的COCs数5～7月和8～10月期间显著（P

关键词：猪卵巢；卵母细胞；月份；温度；时间；体外成熟

中图分类号：S828.3 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）23-5805-03

猪卵母细胞体外成熟（In vitro maturation，IVM）是体外受精技术（IVF）、胞浆单注射技术（ICSI）和克隆技术等成功与否的关键。近几年，猪的卵母细胞体外成熟受到广泛关注。为了解决猪胚胎体外生产中的两个主要难题（细胞质成熟不充分以及多精受精现象），人们首先将目光放在如何提高卵母细胞体外成熟质量上[1，2]。卵母细胞体外成熟的质量对体细胞核移植成功率的影响巨大，目前进行克隆猪和基因修饰猪研究所用的卵母细胞主要有两种来源：体内成熟卵母细胞和体外成熟卵母细胞。应用体内成熟卵母细胞的优点是卵母细胞成熟质量好，核移植后重构胚发育潜能高；缺点是数量有限，获取成本高昂。而体外成熟卵母细胞来自于屠宰场收集的卵巢，因此数量大，成本相对较低，但是其成熟质量与体内成熟卵母细胞有很大差距。

本试验对猪卵巢的采集月份、保存温度、保存时间等因素对猪卵母细胞体外成熟的影响进行了分析与探讨，旨在为提高猪卵母细胞体外培养成熟的质量及猪胚胎体外生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

DPBS购自Gibco公司；孕马血清促性腺激素（PMSG）、人绒毛膜促性腺激素（HCG），宁波激素制品厂；其他试剂如未特别注明，均购自Sigma公司。

1.2 溶液

卵母细胞体外培养液为改良TCM199（mTCM199），添加3.05 mmol/L葡萄糖，0.91 mmol/L丙酮酸钠，0.57 mmol/L L-半胱氨酸，1.00 mmol/L L-谷氨酰胺，10 ng/mL表皮生长因子（EGF），10 IU/mL HCG和10 IU/mL PMSG，75 μg/mL青霉素，50 μg/mL 硫酸链霉素，10%猪卵泡液（pFF）；洗卵液用DPBS；脱卵液用0.1%透明质酸酶。

1.3 方法

1.3.1 卵母细胞的采集和体外成熟培养 猪卵巢从当地屠宰场采集，摘取新鲜卵巢立即置于盛有26～37 ℃生理盐水（含160万IU的青霉素和15万IU的链霉素）的保温瓶内，2 h内送回实验室，用适量生理盐水（26～37 ℃）冲洗3～5次，盛于500 mL 烧杯中，放在水浴锅（37 ℃）上。用镊子夹取卵巢，再用生理盐水润湿灭菌纱布包裹，采用10 mL注射器（16号针头）抽吸直径为3～6 mm 的卵泡，吸取的卵泡液汇集到置于37 ℃水浴保温的锥型灭菌试管中，抽完后静置15～20 min，弃上清液，取试管底部卵泡液于表面皿中，实体显微镜下观察，捡取卵丘卵母细胞复合体（COCs），转移到DPBS 液滴中，冲洗3次，mTCM199 基础培养液洗3次，然后转入盛有mTCM199基础培养液的5孔板中。

1.3.2 猪卵泡液（pFF）的制备 抽取卵巢上3～6 mm 直径的卵泡，将抽取的卵泡液放入离心管中离心（3 000 r/min）18 min，取上清液，于超净工作台内以0.22 μm滤膜过滤后分装于0.5 mL离心管中，-20 ℃冷冻保存备用。

1.3.3 卵母细胞成熟的观察及鉴定 COCs培养44 h，在4×10倍实体显微镜下观察卵丘细胞扩散情况及胞质发育是否均匀，然后将COCs转移到0.1%透明质酸酶溶液中，用移液器轻轻吹打脱去颗粒细胞，以第一极体排出作为卵母细胞成熟的主要指标。

1.4 数据分析

用t检验与方差分析对试验数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 卵巢采集月份对猪卵母细胞体外成熟的影响

本试验在不同的月份采集卵巢，并且对抽取的卵母细胞的成熟率进行观察，其结果见表1。由表1可见，5～7月和8～10月期间从屠宰场所取卵巢的COCs数量显著高于2～4月和11月至次年1月（P

2.2 卵巢保存温度对猪卵母细胞体外成熟的影响

由表2可见，将采集的猪卵巢分别置于15、20、25、30和35 ℃的生理盐水中各2 h，收集到的卵巢的COCs数差异不显著（P>0.05），但是存放于30和35 ℃的生理盐水中，其卵母细胞的体外成熟率极显著（P

2.3 卵巢保存时间对猪卵母细胞体外成熟的影响

将采集的猪卵巢分别置于35 ℃的生理盐水中2、4、6、8 h，比较其COCs数及卵母细胞的体外成熟率，其结果见表3。由表3可见，不同存放时间下其COCs数差异不显著（P>0.05），但存放2 h的卵巢其卵母细胞的体外成熟率与存放4、6和8 h相比差异显著（P

3 小结与讨论

3.1 卵巢采集月份对猪卵母细胞体外成熟的影响

大部分屠宰场一年四季都在屠宰生猪，所以猪卵巢的供应是不间断的。然而在试验过程中常常会遇到不同的季节猪卵母细胞体外成熟的质量有显著的差别。本试验结果表明采集猪卵巢最适宜的月份为5～10月，其他季节采集的猪卵巢卵母细胞体外成熟率与这一季节相比差异显著。研究表明季节变化引起的诸如环境温度的冷热应激等可使母猪卵巢功能减退，受胎率降低，胚胎存活率下降，流产增加[3，4]。屠宰场初情期前母猪来自不同的养殖场，因此在四季转变过程中光周期、不同养殖场饲料成分以及管理方式的不同等都会导致猪卵巢卵母细胞体外发育能力的差异[5]。特别在国内养殖业整体科技含量还不高的背景下，畜舍夏季的防暑降温和冬季的保暖工作还不是很完善，其恶劣的环境极易影响即将出栏的初情期前母猪的繁殖力，进而造成其卵母细胞体外发育能力的差异。这可能是生物自身调节从而有利于生殖的一种方式。试验结果表明季节变化对猪卵母细胞体外发育能力有较大影响。

3.2 卵巢保存温度对猪卵母细胞体外成熟的影响

大量的研究结果表明，卵巢不同保存温度对猪卵母细胞的体外成熟有很大影响。First等[6]报道，当卵巢的贮存温度低于30 ℃时，会对卵母细胞的成熟和随后的胚胎发育产生不利的影响。邢凤英等[7]也报道，分别在22.0、30.0、37.0、38.5、40.0 ℃下保存卵巢，随着温度的升高，其卵母细胞体外成熟后的质量、激活后的卵裂率和囊胚率均明显下降，当达到40.0 ℃时成熟培养后卵子的死亡率明显增加，激活后卵裂的形态异常率明显增加，细胞质不均匀，碎裂率升高，不能发育到囊胚，认为37 ℃的生理盐水保存猪卵巢效果最佳。以上报道与本试验结果基本一致，猪卵巢保存温度在30～35 ℃时其卵母细胞成熟率、卵裂率最高，而低于20 ℃时其卵母细胞成熟率、卵裂率显著下降。但也有研究[8，9]表明，猪卵巢在4 ℃放置12～24 h后其卵裂率不受明显影响。从常理上讲，应该是保存温度降低得越少越好，但有时结果并不是这样，其原因可能是猪接近排卵时卵泡内温度低于卵巢基质温度网，采用与猪卵母细胞体外成熟温度一样温度的生理盐水收集卵巢，对其卵巢内卵泡卵母细胞有不良影响，当采用和体外培养相同或更高温度的生理盐水保存卵巢时，卵子受到热应激而影响其成熟后的质量。或者是因为天气原因，采集卵巢时生理盐水温度下降幅度较大，影响了猪卵母细胞的体外发育所致。

3.3 卵巢保存时间对猪卵母细胞体外成熟的影响

本试验研究结果表明，从屠宰场获取猪卵巢带回实验室收集卵母细胞的时间以2 h之内最好，最晚不超过6 h。猪卵巢置于35 ℃的生理盐水中2 h，然后采集卵丘卵母细胞复合体，其卵母细胞的体外成熟率明显高于其他各组。猪卵巢保存时间越长，其卵母细胞体外成熟质量越差。王峰[10]研究发现，牛的卵巢在24～25 ℃贮存8 h，其卵母细胞的成熟率无明显下降。在生发泡阶段分离的卵母细胞比卵泡内的卵母细胞对冷刺激更加敏感，将生发泡期的卵母细胞在0 ℃处理30 min，只有1%的卵母细胞能够发育到囊胚[11]，这可能是由于MⅡ期的纺锤体形成异常所致[12]。而在卵泡内的卵母细胞，由于卵泡内环境的保护，可以使卵母细胞免受低温的损伤，因而其发育能力没有受到影响。保存在35 ℃的猪卵巢，会随着保存时间的延长，卵泡液的pH降低，卵母细胞核DNA碎片化的比率升高，从而降低了卵母细胞的成熟能力[13]。

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