抗核抗体复筛查试验阴性与特异性抗体确认试验阳性的关联

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[摘要] 目的 探讨抗核抗体（ANA）复筛查试验阴性与特异性抗体确认试验阳性的关联。 方法 对2065例间接免疫荧光法（IIF）检测阴性结果的样本进行免疫印迹法（LIA）检测，并使用ELISA进行辅助检测。观察IIF阴性结果下LIA、ELISA检测结果，并对样本稀释度对结果的影响进行深入研究。 结果 165例IIF阴性样本经LIA确认为阳性，其中以SS-A最多，达到29.76%。通过ELISA检测SS-A，发现与LIA符合率达到88.0%；而通过降低样本稀释度，可以发现50%的样本是因为特异性抗体的浓度较低才漏检的。 结论 对于高度怀疑为AID的患者，不管IIF检测是否为阳性，都应该进行LIA的复检，以提高检测的准确性。

[关键词] 抗核抗体；特异性抗体；间接免疫荧光法；免疫印迹法

[中图分类号] R446.6 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2013）20-0070-03

抗核抗体（ANA）检测是目前临床上诊断自身免疫性疾病（AID）最重要、可靠的一种实验室诊断手段，其中间接免疫荧光法（IIF）的使用最为广泛[1，2]。随着实验技术的进一步发展，目前其他针对特异性抗体（ANAs）的新型检查手段也不断出现，如ELISA、免疫扩散及免疫印迹等[3，4]。临床工作中，IIF常常作为初步检测存在，对检测结果呈现阳性的样本进行特异性抗体确认试验[5]。但临床工作中发现，有时IIF与特异性抗体确认试验结果差异较大。我科对2 065份IIF检测阴性样本进行免疫印迹法（LIA）检查，共发现15种特异性抗体。本研究试图阐述IIF阴性样本与LIA检查的关系与意义，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本研究共纳入受试者2 065例，均为我院2010年1月～2012年12月各科室申请ANA检测的患者，ANA检测均采用IIF，检测结果均为阴性。其中男972例，女1 093例，年龄37～69岁，平均（52.1±13.3）岁。患者均为清晨空腹抽取肘静脉血液5 mL，血液经离心机离心5 min，转速3 000 r/min，分离出血清。

1.2 IIF检测

IIF检测试剂盒购自德国欧蒙公司，将分离出的血清稀释，并使其与抗原基质片反应，时间为30 min（同时设阳性和阴性对照），浸泡5 min，然后加入荧光标记的二抗，避光孵育30 min，浸泡5 min。最后用甘油封片，在荧光显微镜下观察并记录结果，阳性结果为抗体滴度≥1∶100。

1.3 LIA检测

LIA检测试剂购自德国欧蒙公司，特异性抗体检测包括抗nRNP/Sm、Sm、SS-A、Ro-52、SS-B、Scl-70、PM-Scl、Jo-1、着丝点蛋白B（CENP B）、增殖细胞核抗原（PCNA）、双链DNA（dsDNA）、核小体（Nucleosome）、组蛋白（Histone）、核糖体（rRNP）以及线粒体-M2（AMA-M2）等15种。在第一次温育时，将已经1∶100稀释的血清样本2 mL与膜条上的靶抗原反应，等待30 min后洗涤3次，共计15 min。之后加入抗人IgG（酶结合物，已经酶标记）1.5 mL反应，等待30 min后洗涤3次，共计15 min。最终加入底物液反应15 min，并用蒸馏水洗涤膜条，肉眼观察反应结果。

1.4 ELISA定性检测抗SS-A

试剂盒购自德国欧蒙公司，以20 RU/mL的吸光度（A）值为定性分析临界值。标本1∶200稀释，450 nm波长比色。

1.5 正常对照组

选取20份经IIF、LIA检测均为阴性的血清样本作为对照，稀释度分别为1∶10、1∶32。

1.6 统计学方法

应用SPSS 14.0软件，计数资料采用χ2检验，P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IIF检测阴性与LIA检测

2 065例血清样本，IIF检测后均为ANA阴性。所有样本经LIA检测，2 065例样本中，有165例为ANA阳性。

2.2 LIA特异性抗体检测分析

我们对165例IIF检测阴性、LIA检测阳性的样本进行特异性抗体检测分析，发现包含15种不同的特异性抗体，见表1。

表1 LIA特异性抗体检测分析

2.3 LIA检测SS-A阳性标本与ELISA复检分析

根据表1中的结果，可以发现SS-A的IIF检测漏检率最高，达到了29.76%。因此，将SS-A作为代表，进行进一步检测。我们对经LIA检测SS-A阳性血液样本进行ELISA检测，发现ELISA检测后SS-A阳性例数为44例，一致性达到88.0%。见表2。

表2 LIA检测SS-A阳性标本与ELISA复检分析

2.4 血液样本稀释度与IIF检测SS-A阳性分析

我们对初始样本采用1∶100的稀释比例，结果50例IIF检测SS-A为阴性。因此，我们降低样本的稀释度，结果发现经过降低稀释度后，有50%原本SS-A阴性的样本呈现阳性结果，与对照组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表3。

表3 血液样本稀释度与IIF检测SS-A阳性分析

注：*与对照组比较，P < 0.05

3 讨论

抗核抗体（ANA）是一组将自身真核细胞的各种细胞核成分作为靶抗原的自身抗体的总称，是目前自身免疫性疾病最常用的筛查指标，主要存在于血清中，也可在胸水、关节滑膜液和尿液中出现。抗核抗体在大多数自身免疫性疾病中均可呈阳性，如SLE、RA、混合型结缔组织病、干燥综合征、硬皮病、多发性肌炎等，因此，ANA检测目前普遍应用于临床诊断AID的工作当中，也是当前条件下确诊疾病、提供治疗的主要依据[6]。IIF曾作为临床上自身抗体检测的主要手段，由于其具有敏感性高、检测方便以及能够对细胞核、细胞浆、细胞骨架、细胞周期等自身抗体具有检测范围广等优点，一直作为自身抗体检测的“金标准”[7-9]。随着临床诊疗与检查技术的发展，发现IIF检查缺乏特异性，因此对于一些AID疾病的诊断上存在一定的漏误诊可能[10]。随着研究的深入，目前实验室研究已经发现并确认了许多细胞核靶抗原，相应的特异性检查手段也越来越多[11]。目前实验室检测常用的有ELISA、免疫扩散以及免疫印迹等。LIA是近年来研究较多的一种检测方法，研究表明[12]，LIA具有快速简单、自动化操作等优点，而且结果迅速易读。此外，LIA一次可以检测AID相关的多种特异性自身抗体，对AID的诊断和鉴别诊断、病情评估与治疗监测、病程转归与预后判断等具有重要的临床价值，且检测的敏感度与准确性相对较高，与ELISA同样有着极高的诊断作用[13]。在日常检验工作中，IIF常常作为AID疾病患者的初步诊断，但已有一些文献显示，IIF检测的自身抗体与LIA检测特异性抗体往往存在较大程度的差异[14，15]，因此本研究对IIF检测阴性的血液样本进行LIA特异性抗体检测。通过对两者不同结果进行分析，阐述该类标本检测自身特异性抗体的临床意义。

本研究发现，2 065例IIF检测ANA阴性样本，经过LIA检测后165例为阳性结果。经过分析，我们发现，50例为SS-A的漏诊，漏诊比例明显大于其他特异性抗体。因此，我们将SS-A作为代表进行了进一步研究。首先，我们采用ELISA对50例样本进行ANA检查。结果发现，ELISA检查下44例为阳性结果，阳性率为88.0%。说明LIA与ELISA在检测特异性抗体方面，具有较高的符合率。因此，我们将样本的稀释度改变并进行了IIF的重新检测，结果发现在1∶10时，ANA阳性为17例，1∶32时，ANA阳性为8例，而1∶10时ANA阴性为25例。对照组中，1∶10时，ANA均为阴性。结果提示，50%的样本是因为特异性抗体的浓度较低才漏检的。

综上所述，IIF检测自身抗体能够出现15种类型特异性自身抗体的漏检，而其中以SS-A漏检率最为严重（29.76%）。因此，对于高度怀疑为AID的患者，不管IIF检测是否为阳性，都应该进行LIA的复检，以提高检测的准确性，为AID的临床诊断提供实验室诊断依据。

[参考文献]

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（收稿日期：2013-05-13）