220例无症和严重少症患者遗传学分析

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【摘 要】 目的:检查无、严重少患者的染色体异常和Y染色体上无基因(AZF)微缺失的遗传缺陷。 方法：应用外周血培养和聚合酶链反应（PCR）技术，对220例无、严重少患者的染色体和11个AZF基因位点进行检查。结果：在140例无患者中，发现19例患者染色体异常，异常率为13.57%。有21例患者有AZF基缺失，总缺失率为20.31%，AZFa、AZFb、AZFc缺失率分别为2.38%、4.76%、16.67%。在80例严重少患者中，有14例患者有AZF基因缺失，总缺失率为17.50%，AZFb和AZFc的基因片段缺失率分别为1.25%和17.50%。未发现有染色体异常和AZFa缺失。结论：染色体异常和无基因微缺失是导致无症、少症主要因素，遗传学检查对男性不育患者的病因诊断与治疗有着重要价值。

【关键词】 不育症； 男性； Y染色体； AZF； 无症； 少症

已婚育龄夫妇不孕症的发病率高达10%~15%，其中男性不育约占40%，特发性无症和严重少是男性不育的主要类型。引起无或严重少的原因极其复杂，遗传缺陷是其中的重要原因之一。男性无和严重少患者除染色体异常外，Y染色体长臂有控制生成的无因子（Azoospermia factor，AZF），这一区域的基因微缺失与无和严重少密切相关。我们通过对无症和严重少患者外周血染色体和Y染色体上AZF缺失的检测，探讨了引起无和少的遗传因素和AZF缺失与表型效应的关系，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象

来自我院不育门诊就诊的男性不育患者。根据世界卫生组织标准进行常规分析、果糖测定、脱落细胞学检查等，并排除继发感染、输精管缺如、其它外伤等病症，经确诊为无或严重少病例作为研究对象。无症140例，严重少患者80例。按设计表格逐一填写个人一般状况、个人发育史、生育史、既往病史、体格检查等情况。无症和严重少病例年龄22~40岁，平均29.03±3.35岁 。以我院优生门诊和沈阳市第一医院妇产科有正常生育史患者的丈夫30例为对照组，以10例正常女性为阴性对照组，年龄24~35岁，平均28.12±2.83岁。

1.2 方 法

1.2.1 分析

根据世界卫生组织评估标准，每例患者重复两次以上检测，留取标本前应禁欲3~5天。无患者，经连续三次分析，并经离心沉淀均无者确诊为无症，并排除继发感染、输精管缺如、其它外伤等病症。密度低于5×106/ml为严重少症。

1.2.2 激素测定

采用SEROZYME I 磁分离酶联免疫测试仪（瑞士）测定血清中卵泡刺激素（FSH）、黄体生成素（LH）、睾酮（T）激素，试剂为SEROZYME专用进口试剂。

1.2.3 染色体检查

采用本室常规外周血染色体检查方法，镜下每例计数30个分裂相，G染色体显带核型分析5个。

1.2.4 Y染色体上缺失基因检测

1.2.4.1 无基因引物

根据文献资料，在Y染色体长臂5~6区30个基因片段位点分别选择了引物AZFa区sY84、sY86，AZFb区sY102、sY134，AZFc区sY147、sY153、sY157和RBM，引物由中国科学院微生物研究所合成。它们的PCR扩增产物DNA长度分别为326bp、320bp、218bp、301bp、100bp、139bp、285bp 和825bp。

1.2.4.2 PCR反应检测分析 1）标本DNA提取：采集患者外周血3ml，肝素抗凝，3000 rpm离心20min，取白细胞层加入等量的裂解缓冲液，充分混悬。15000rpm离心3min，去上清，沉淀加入1ml裂解液，重复1~2次，常规法提取DNA备用。

2）反应条件：25μl反应体系100 μl 10×缓冲液（10mM Tris-HCl，pH8.3，500mM KCl，15mM MgCl2），8μl dNTP混合物（每种核苷酸12.5mM），DNA聚合酶8μl（5UI/μl ），引物浓度按每反应体系50pmol加入超纯水295μl；混合后分装每反应管22μl，加入模板DNA3μl 。在PE480PCR扩增仪进行基因扩增。94℃预变性5min，94℃30sec，54℃45sec，65℃120sec，共完成45个循环，最后65℃5min延伸，PCR扩增产物置4℃冰箱中储存。3)产物检测分析：

每PCR反应管中加入载样缓冲液3μl，吸取10μl加样,用3%琼脂糖凝胶（含0.5μg /ml，溴化乙啶）电泳，电压8伏/cm，在紫外透射仪下观察结果。

2 结果

2.1 染色体分析

在140例无患者中，发现19例患者染色体异常，异常率为13.57%，其中47，XXY14例，46，XY，del（Yq12）2例，46，XY，del（Yq）1例，46，XY，inv（9）2例。此外还发现4例患者Y染色体长臂明显增大。80例严重少患者中未发现有染色体异常。

2.2 无基因检测

2.2.1 在140例无患者中，除14例47，XXY患者未做无基因检查外，其余全部进行8个基因位点的无基因测定。结果表明，有21例患者有AZF基因缺失，总缺失率为20.31%。其中2例sY84缺失，3例sY86缺失， 5例sY102缺失，6例sY134缺失、6例sY147缺失，15例sY153缺失，16例sY157缺失，4例RBM缺失。缺失率分别为1.59%、2.38%、3.79%、4.76%、4.76%、11.90%、12.70%和3.17%。AZFa、AZFb、AZFc、RBM缺失率分别为2.38%、4.76%、16.67%、3.17%。有3例同时存在AZFa、AZFb、AZFc缺失，有3例同时存在AZFb、AZFc缺失，15例为单纯AZFc缺失，RBM基因缺失同时伴AZFc缺失。

2.2.2 在80例严重少患者中，有14例患者有AZF基因缺失，总缺失率为17.50%。其中AZFb区域1例sY102和sY134缺失，AZFc区域5例sY147缺失、11例sY153缺失、12例sY157缺失，1例RBM缺失。缺失率分别为1.25%、1.25%、7.50%、13.75%、15.00%、2.50%。未发现AZFa区域的sY84和sY86s缺失，AZFb和AZFc的基因片段缺失率分别为1.25%和17.50%。

2.2.3 30例正常对照组未发现8种基因片段缺失；10例女性对照，8种引物未扩增出产物。

2.3 无症患者精浆脱落细胞检查

在126例无症患者中，有23例患者检查到有生精细胞，103例未见到生精细胞，21例AZF缺失患者中有4例中有生精细胞，占19.05%；105例无AZF缺失患者中有19例中有生精细胞，占18.09%。两者无显著差异（P＞0.05）。见表1。

2.4 睾酮、黄体生成素、促卵泡刺激素水平

患者血清中T、LH、FSH激素平均浓度均在正常范围，无症患者血清中T、LH、FSH分别为（4.11±1.05）ng/ml、（9.91±6.23）mIU/ml、（10.27±8.25）mIU/ml；严重少症患者血清中分别为（6.48±2.26）ng/ml、（10.45±5.61）mIU/ml 、（15.02±11.23）mIU/ml；AZF缺失患者分别为（5.04±1.34）ng/ml、（11.21±6.81）mIU/ml、（10.52±8.47）mIU/ml。除无症T浓度明显低于严重少症（P

3 讨论

引起无和严重少的原因很多，遗传物质改变是其中主要因素，其中染色体异常约10%~15%，主要以47，XXY占绝大多数，还有一些结构异常，包括常染色体和性染色体。但是，性染色体数目异常和Y染色体与常染色体易位均表现有第二性征改变，常染色体和Y染色体部分缺失、增加一般副性征正常。本文无患者染色体异常发生频率为13.57%，与文献报道[1]相吻合。

自从Tiepolo[2]等人首次发现Y染色体长臂荧光区缺失的病人生成障碍后，一些学者对AZF的基因定位、构成和遗传效应进行了大量的研究。Vergnaud[3]应用Y染色体DNA探针建立了人类Y染色体基因图谱，将Y染色体分为7个区，长臂为5、6、7区。Ma[4]对50例无症和严重少症缺失部分进行DNA探针筛查时发现4例6区缺失，且不重叠，揭示AZF是一个基因家族。并首先提出RBM（最初称YRRM）是无生成基因的候选基因。Vogt等[5]证实无因子（AZF）位于Yq11的第5、6区，这两个区域有较多的控制发生的基因片段，分为AZFa、AZFb、AZFc三个区。目前资料报道，在无症和严重少症的患者中，有AZF缺失的约占3%~29%，它是染色体异常导致的无以外的第二个重要因素。

在我们的研究中，126例无症有21例患者有AZF基因缺失，以AZFc缺失最多，缺失率高达16.67%。AZFa、AZFb、RBM缺失率较低，而且均伴有AZFc缺失。80例严重少患者中有14例患者有AZF基因缺失，主要以AZFc缺失为主，缺失率为17.50%，AZFb基因片段缺失仅为1.25%，而且未发现AZFa区域缺失。所以，Yq11的AZFb、AZFc区域的微基因缺失是引起无和严重少的主要原因。此外，我们的研究发现无症和严重少症中多数病例同时微缺失2个以上基因片段，说明AZF是个多基因的大家族，有许多不育基因与之有关。以往报道RBM基因族是无和严重少精的主要候选基因，RBM在AZFb区内，它的缺失对发生有影响。我们的结果是无中RBM缺失率仅占3.17%，而且，同时伴有AZFc缺失。本研究AZFa缺失很少，与以前报道的无与AZFa缺失有关不大一致，而主要是AZFc缺失,尽管我们对这个区域检测的数量有限，但也提示AZFc区域的缺失导致生精障碍要比AZFb和AZFa区域缺失更常见，也有类似文献报道[6]。

文献资料表明[7]，睾酮是间质Leydig细胞产生的，除维持男性第二性征和的作用外，睾酮分泌减少将导致发生减缓。FSH主要促进生成和成熟，在青春期FSH可促进重量增加和曲细精管直径增大。LH可刺激Leyig细胞合成和分泌睾酮，并将睾酮直接通过间质细胞作用于生精上皮细胞。我们对患者血清中激素水平测定结果表明，除无症睾酮明显低于严重少患者外，无、少和基因缺失患者的LH、FSH等激素水平均没有明显差异，没有发现基因缺失与激素变化的关系。

Vogt[5]等并通过病人的组织分析发现，AZF基因缺失在同一区域，发生受阻也在同一时期。AZFb缺失表现为生殖细胞成熟障碍，内只见精原细胞和初级精母细胞，中无。AZFc的表现有两种，可见精原、精母、精细胞、；仅见支持细胞，数量减少。我们对126例无患者进行脱落细胞检查，发现仅有23例患者检查到有生精细胞，103例未见到生精细胞，而且AZF缺失患者中有生精细胞人数和无AZF缺失患者中有生精细胞人数两者无显著差异。因此，AZF微缺失与无或少患者的表型效应关系需进一步探讨。

我们的研究支持AZF区域微缺失与无之间有着因果关系，尤其是AZFc区的缺失的报道[8]。但是，大部分生成障碍尚未检查出原因，可能受Yq11缺失多个基因位点影响，我们仅检测了部分基因片段。此外，AZF的点突变也可能对生成有影响。因此，有关生成基因的课题尚待深入研究。鉴于染色体异常和AZF微缺失与无、少关系密切，遗传学检查对男性不育患者的病因诊断有着重要价值。

参考文献

1 韩维田,曲鸥,孙晓玲,等.81例男性不育患者细胞遗传学分析[J].中华医学遗传学杂志,1992，9（1）：40.

2 Tiepolo L & Zuffardi O. Location of factors conrtolling spermatogenesis in the nonfluorescent portion of the human Y chromosome long arm[J]. Hum Genet,1976, 34:119.

3 Henegariu O, Hirschmann P , Kilian K , et al. Rappid screening of the Y chromosome in idiopathic sterle men,diagnostic for deletions in AZF ,a genetic Y factor expressed during spermatogenesis[J]. Andrologia ,1994,26:97.

4 Ma K, Inglis JD & Sharkey A .A Y .chromosome gene family with RNA-binding protein homology:candidates for the azoospermia factor AZF contrlling spermatogenesis[J]. Cell,1993,75:1287.

5 Vogt PH, Edelman A , Kirsch S, et al. Human Y-chromosome azoospermia factor (AZF) mapped to different subregions in Yq11[J]. Hum Mol Genet, 1996, 5:933.

6 Yao G, Chen G, Pan T. Study of microdeletions in the Y chromosome of infertile men with idiopathic oligo- or azoospermia[J]. J Assist Reprod Genet , 2001,18(11):612.

7 黄宇烽,许瑞吉.男科诊断学[M].上海：第二军医大学出版社,1999，388.

8 Kim SW, Kim KD, Paick JS. Microdeletions within the azoospermia facfor subregions of the Y chromosome in patients with idiopathic azoospermia[J]. Fertil Steril ,1999,72(2):349.

［收稿日期：2009-03-16］