柑橘黄龙病LAMP快速检测方法的建立及应用
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摘要：【目的】为了建立柑橘黄龙病菌亚洲种lamp快速检测方法。【方法】根据黄龙病菌亚洲种外膜蛋白基因，在种属特异保守区域的6个位点设计2对特异性引物，对反应条件和体系进行优化，并通过产物沉淀观察和SYBR Green I荧光染料显色的方法来快速判读检测结果。同时对田间样品进行了特异性和灵敏度分析试验。【结果】该方法仅需63 ℃反应70 min即可得到结果，特异性强，灵敏度高。对柑橘常见病害样品进行LAMP扩增，仅HLB阳性样品扩增产物电泳呈特征性梯状条带。检测灵敏度比常规PCR高100倍，与实时定量PCR相当。在对105份黄龙病田间疑似样品检测中，LAMP阳性检出率为52.4%，常规PCR为37.1%，2种检测方法符合率为84.7%。【结论】建立的黄龙病菌亚洲种LAMP检测方法，快速简便、特异性强、灵敏度高，为快速检测柑橘黄龙病提供了新方法和新思路。
关键词： 柑橘黄龙病菌亚洲种； 外膜蛋白基因； 环介导等温扩增技术
柑橘黄龙病（Citrus Huanglongbing， HLB）是世界柑橘生产上最具毁灭性的病害之一，是国内外植物检疫对象。目前主要分布在亚洲、非洲、大洋洲、南美洲和北美洲的近50个国家和地区，中国19个柑橘生产省（市、自治区）中已有11个受到该病危害，严重制约柑橘产业的健康发展。其病原物暂定为α-变形菌纲韧皮部杆菌属（Candidatus Liberibacter），包括亚洲种（‘Ca. L. asiaticus’）、非洲种（‘Ca. L. africanus’）和美洲种（‘Ca. L. americanus’）[1-2]，在我国该病害主要由亚洲种引起[3]。田间症状表现为病树的黄梢和叶片的斑驳型黄化，果实小，畸形，严重影响柑橘的品质与产量。由于目前缺乏有效药剂和抗病品种，主要采取砍除病树、防治木虱和种植无病苗木等防控措施，因此加强柑橘黄龙病的早期诊断显得尤为重要。传统的指示植物[4]、电镜[5]和血清学[6]等诊断方法不仅费时费力，而且效率低；近年，常规PCR[7]、巢式PCR [8]和实时定量PCR[9-10]已应用到柑橘黄龙病的检测上，但是 PCR 检测技术需要特殊仪器设备且检测成本较高，不适合在田间大规模快速应用，因此，在加强柑橘苗木检疫监测中，迫切需要一种成本低廉、操作简便、结果判断快速、灵敏度高和特异性强的柑橘黄龙病检测方法。
日本学者Notomi等[11]于2000年开发了一种新型的恒温核酸扩增方法，即环介导等温扩增法（Loop-mediated isothermal amplification， LAMP）。该技术针对靶基因的6个特定区域设计4条特异引物，借助具有链置换作用的DNA聚合酶（Bst DNA polymerase），在等温条件下进行靶序列高效扩增。它避免了常规 PCR 温度循环的特殊要求，因其简便、高效，成本低、检测周期短等优点，具有较高的应用价值。LAMP检测技术已广泛应用于临床、食品、农业等领域，目前在植物中主要集中在植物病毒、细菌、真菌性病害及转基因作物的检验检疫工作中[12-15]，具有较大的开拓空间。因此，我们主要运用LAMP技术，建立一种柑橘黄龙病的快速检测方法。
1 材料和方法
1.1 供试材料
从我国7省（市、区）收集黄龙病疑似样品，大部分由中国农业科学院柑桔研究所国家苗木脱毒中心田间调查采集，少量样品由现代柑橘产业体系综合试验站和各地植保植检系统工作人员提供，所有样品4 ℃保存备用。溃疡病、黑星病、炭疽病和褐斑病等柑橘病害的DNA模板在国家苗木脱毒中心实验室-20 ℃保存。
1.2 主要试剂
Bst DNA聚合酶购自北京纽英伦生物技术有限公司；氯化钾、硫酸铵和硫酸镁等购自Sigma公司；10000×SYBR Green I购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；Trans1-T1 Phage Resistant 化学感受态购自北京全式金生物技术有限公司；Ssp I限制性内切酶、DNA标准分子量和PCR相关试剂购自Takara和Promega公司。
1.3 DNA的提取
利用CTAB法提取柑橘叶脉基因组DNA，提取方法参照Murray等[16]方法，样品-20 ℃保存备用。
1.4 LAMP引物的设计
根据NCBI公布的‘Ca. L. asiaticus’基因组的外膜蛋白基因保守序列（Genbank登录号：AY842429），利用PrimerExplorer V4在线软件（http：//primerexplorer.jp/e/）在种属特异保守区域设计外引物对（F3和B3）和内引物对（FIP和BIP）；引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。序列信息见表1。
1.5 LAMP反应体系和反应条件的优化
分别对反应体系（Mg2+、dNTPs、Betaine、omp-FIP/BIP和omp-F3/B3的浓度等）和反应条件（反应温度和时间）进行优化，每个因子设置3个重复试验。Mg2+终浓度分别为0、2、4、6、8、10、12、14 mmol·L-1；dNTPs终浓度分别为0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mmol·L-1；甜菜碱（Betaine）终浓度分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mol·L-1； omp-FIP/BIP终浓度分别为0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 μmol·L-1；omp-F3/B3终浓度分别为0、0.1、0.2、0.3、0.4 μmol·L-1；反应温度采用57、59、61、63、65 ℃依次递增；反应时间分别采用10、20、30、40、50、60、70、80、90 min。在25 μL反应体系中，5×Reaction Buffer[100 mmol·L-1 Tris-HCl pH 8.8、50 mmol·L-1 KCl、50 mmol·L-1 （NH4）2SO4、0.5% Tween 20]、Bst DNA 聚合酶8 U、模板1.0 μL、加ddH2O补足至25 μL，混匀，于65 ℃水浴锅中反应80 min，之后80 ℃下灭活5 min结束反应，取5 μL 反应产物上样于2%琼脂糖凝胶电泳鉴定，以确定最佳反应体系和反应条件。
1.6 LAMP特异性检测及其产物内切酶鉴定
采用优化后的反应体系和反应条件，以柑橘黄龙病、溃疡病、黑星病、炭疽病、褐斑病及健康样品DNA为模板，以双蒸水代替DNA模板作空白对照进行LAMP反应，检测该方法的特异性。取LAMP 产物4.0 μL，加10×Ssp I Basal Buffer 2.0 μL、Ssp I限制性内切酶1.0 μL、加ddH2O至总体积20 μL，37 ℃ 反应4 h 后取8 μL 酶切产物在2%琼脂糖凝胶上电泳，经10 g·L-1溴化乙锭（EB）染色后，使用凝胶成像系统观察结果，LAMP 产物经Ssp I 酶切，理论上酶切产物为70 bp和133 bp。
1.7 LAMP与实时定量PCR和常规PCR灵敏度的比较
将纯化的PCR产物直接与pMD19-T载体16 ℃连接过夜，重组T载体转化Trans1-T1 Phage Resistant化学感受态，用Plasmid Mini Kit提取重组质粒DNA，核酸浓度测定仪测定其D 260nm/D 280nm值，计算样本DNA的拷贝数，取1.0 μL提取的质粒DNA，并做10倍梯度稀释，用于检测LAMP方法的灵敏度。实时定量PCR和常规PCR的灵敏度试验均采用LAMP的2条外引物（omp-F3和omp-B3）。25 μL实时定量PCR反应体系为：2×SYBR Premix ExTaqTMⅡ12.5 μL，5 μmol·L-1 omp-F3/B3混合物1.0 μL，模板1.0 μL，加ddH2O补足到25 μL。扩增程序为：95 ℃预变性30 s；PCR反应95 ℃ 5 s，63 ℃ 30 s，40个循环，在63 ℃同步采集荧光；熔解曲线过程为95 ℃ 15 s，65 ℃ 15 s，从65 ℃开始每个循环升高0.5 ℃，连续升高60次（到95 ℃为止）。 25 μL 常规PCR反应体系为：10×Buffer 2.5 μL，25 mmol·L-1 MgCl2 2 μL，10 mmol·L-1 dNTPs 0.3 μL，5 μmol·L-1 omp-F3/B3混合物1.0 μL，5 U·μL-1 r Taq DNA聚合酶0.3 μL，模板1.0 μL，加ddH2O补足到25 μL。扩增程序为：95 ℃ 预变性2 min，95 ℃变性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸12 s，35个循环后，72 ℃延伸5 min。预期片段大小为194 bp，取扩增产物6.5 μL，在1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳检测，经EB染色后，使用凝胶成像系统观察结果。以上试验，均设置至少3次重复。
2 结果与分析
2.1 LAMP反应体系和反应条件的优化
2.1.1 反应体系的优化 优化后的反应体系 （25 μL） 确定为：8 mmol·L-1 Mg2+、1.2 mmol·L-1 dNTPs、1.6 μmol·L-1 omp-FIP/BIP、0.2 μmol·L-1 omp-F3/B3、Bst DNA 聚合酶8 U、5×Reaction Buffer，模板DNA 1.0 μL。根据实验结果，甜菜碱浓度的逐步增加，对扩增结果未见明显变化，因此确定不需要添加甜菜碱。
2.1.2 反应条件的优化 反应温度。用优化后的反应体系对反应温度进行最适选择，当温度在57 ℃时，未见梯状扩增条带，当温度在59 ℃、61 ℃、63 ℃和65 ℃时，扩增条带逐渐变得明亮清晰（图1）。因此，选择63 ℃作为LAMP反应的最佳反应温度。
反应时间。当反应30 min后，开始出现微弱扩增条带，随着时间的延长，条带逐渐明亮清晰，当反应到70 min左右时，能检测到3.9×101拷贝的质粒DNA模板（图2）。因此，选择70 min作为LAMP反应的最佳反应时间。
2.2 LAMP扩增产物的分析
反应结束后，扩增产物可以通过琼脂糖凝胶电泳，获取电泳图谱，出现特征性梯状条带为阳性，未出现特征性梯状条带为阴性（图版-A）；也可以通过观察浊度或者短暂离心观察沉淀，出现白色浑浊或白色沉淀即为阳性，否则为阴性（图版-B）；若在反应液中加入1000×SYBR Green I显色液，出现绿色表明为阳性，橙色则表明为阴性（图版-C）。结果表明，LAMP产物采用瞬时离心观察焦磷酸镁白色沉淀和SYBR Green I荧光染料显色，结果与电泳一致。
2.3 LAMP特异性检测及其产物内切酶鉴定
以优化的LAMP检测体系对柑橘黄龙病、溃疡病、黑星病、炭疽病、褐斑病及健康样品进行LAMP扩增反应，只有HLB DNA模板有特异性扩增条带，而其他模板均未见扩增条带（图3-A），表明LAMP方法特异性强。LAMP产物经Ssp I限制性内切酶酶切后得到大约70 bp和133 bp的条带（图3-B），酶切产物与理论值相符。
2.4 LAMP与实时定量 PCR和常规PCR灵敏度的比较
采用LAMP和实时定量PCR进行检测时，质粒DNA拷贝数为3.9×101的模板仍可以扩增，而常规PCR在质粒拷贝数为3.9×103时，才得到微弱的扩增条带（图版-D～H）。表明LAMP方法与实时定量PCR检测灵敏度相当，但比常规PCR高100倍。
2.5 田间样品的应用检测
应用建立的LAMP方法对105份黄龙病田间疑似样品进行检测，并与常规PCR方法比较。结果表明，LAMP检出55份阳性，阳性率为52.4%，其中有39份用PCR方法检测也为阳性，阳性率为37.1%，2种检测方法符合率为84.7%（表2）。
3 讨 论
本研究基于外膜蛋白靶基因，建立并优化了柑橘黄龙病菌亚洲种LAMP快速检测方法。针对本套引物，Mg2+浓度在8 mmol·L-1时反应条带最佳，与之前文献报道的Mg2+最佳浓度为8 mmol·L-1相一致[17-18]，引物和dNTPs浓度对反应体系的影响差异不显著。有报道表明添加甜菜碱有助于保持Bst DNA聚合酶的活性和稳定性，使双链 DNA 处于不稳定状态，减少碱基的堆积，从而提高 LAMP 扩增效率[11]，因此本研究对LAMP反应体系中甜菜碱的作用和最适浓度作进一步探索，但结果表明该体系不需要添加甜菜碱即可获得高效扩增。应用建立的LAMP技术对柑橘田间样品进行扩增，仅HLB样品为阳性，并对其产物进行酶切鉴定，均表明该方法具有较强的特异性。在灵敏度分析试验中，该方法最低检出量为3.9×101拷贝，与实时定量PCR检测结果一致，但比常规PCR高100倍；在对105份黄龙病田间疑似样品检测中，LAMP和常规PCR检测结果符合率为84.7%，这些差异进一步证明了LAMP的灵敏度要高于常规PCR方法。最近，Mao等[19] 和Li等[20]应用LAMP检测相关样品，其灵敏度比常规PCR高10倍或100倍以上。由此可见，在灵敏度上表现差异的原因目前尚不清楚，可能是由于引物的扩增效率，也可能是扩增体系的优化问题，或者是不同研究对象DNA样品中某些物质抑制了反应的高效扩增，因此，对优化反应体系和反应条件最佳因子的选择不可一概而论。
Okuda等[21]于2005年在黄龙病菌亚洲种的nus G-rplKAJL-rpoB基因簇区和16S rDNA基因区设计了两组引物，其中以16S rDNA基因区为靶基因的引物扩增产生非特异性条带，因此应用nusG-rplKAJL-rpoB基因簇区建立了黄龙病菌亚洲种的LAMP检测技术，其结果显示，检测灵敏度只能检出近300个基因拷贝，与常规PCR一致。而本研究基于黄龙病菌亚洲种omp基因保守位点设计引物并建立的黄龙病LAMP检测方法，灵敏度明显比其高出一个数量级，并且对反应体系和反应条件相关因子进行了优化组合，建立了更加灵敏特异的检测技术。这种差异的产生，极大可能是由于引物的设计及体系优化所致，因此，对引物，特别是内引物的长度、内引物之间的距离、二级结构、G+C含量、Tm值等都要有严格的要求，尽可能接近引物设计理论值。设计高扩增效率的引物，利于提高LAMP检测病菌的灵敏度。该方法与常规PCR相比较，从DNA抽提到结果的判断，仅约1.5 h，大大缩短了检测时间。LAMP反应结束后，直接短暂离心观察焦磷酸镁白色沉淀[17，22]或添加荧光染料SYBR Green I于可见光或紫外光下观察颜色变化[13，23-24]，可不通过电泳直接快速判读结果，特别适合普通实验室及现场的大批量样品检测。
4 结 论
研究建立的柑橘黄龙病LAMP快速检测技术，特异性强、灵敏度高、方便简捷、成本低廉，无需电泳及特殊仪器设备，特别适合田间样品快速检测。为柑橘黄龙病的检测提供了新的思路，有望成为简易的常规检测手段。（本文图版见插3）
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