聚合度为6～8的壳寡糖的制备

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摘要：目的研究聚合度6～8的壳寡糖的制备工艺。方法选用合适的酶降解壳聚糖，超滤、干燥；用TLC、HPLC、MALDI-TOF-MS检测产品。结果产品为白色，主要为聚合度6～8的壳寡糖。结论此工艺能用于制备聚合度主要为6～8的壳寡糖。

关键词：壳寡糖；聚合度；制备；基体辅助激光解吸电离-飞行时间质谱法

中图分类号：Q53文献标识码：A文章编号：1672-979X(2008)03-0014-03

Preparation of Chitooligosaccharides with Degree of Polymerization of 6 to 8

CHEN Mian, ZHU Xi-qiang*, Li Zhi-ming, GUO Xue-ping

(Institute of Biopharmaceuticals of Shandong Province, Jinan 250108, China)

Abstract：Objective To study the preparation technology of chitooligosaccharides with degree of polymerization of 6~8. Methods Chitosan was hydrolyzed by special enzymes, then the hydrolysis product was successively ultrafiltered, dried and examined with TLC, HPLC and MALDI-TOF-MS. Results The product was white powder and mainly contains chitooligosaccharides with degree of polymerization of 6~8. Conclusion This method can be used for the preparation of chitooligosaccharides with degree of polymerization of 6~8.

Key words：chitooligosaccharide; degree of polymerization; preparation; matrix assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS)

壳寡糖是由β-1,4-糖苷键连接的2-氨基葡萄糖组成的聚合度为2～20的寡糖，其中部分糖残基的氨基上会带有乙酰基，这是由原料壳聚糖的不完全脱乙酰基带来的。壳寡糖，特别是聚合度为6～8的壳寡糖具有良好的抗菌、增强免疫力、抗肿瘤活性，引起广泛关注[1-3]。一般通过化学法、物理法和酶法降解壳聚糖从而制备壳寡糖[4]。但壳寡糖产品由于自身含有氨基和羰基，易发生羰氨缩合而褐变。本实验旨在研究聚合度6～8的壳寡糖的稳定、简便的生产工艺。

1材料和方法

1.1材料

氨基葡萄糖盐酸盐（Sigma公司）；水解粗酶（厂家赠送）；壳聚糖、壳寡糖样品A和壳寡糖样品B（厂家提供）；茚三酮（上海三爱思试剂有限公司）；其他试剂为分析纯。

1.2仪器

Waters高效液相色谱仪；ABI4700基体辅助激光解吸附电离-飞行时间质谱仪。

1.3方法

1.3.1酶解壳聚糖取壳聚糖溶于稀酸溶液，调pH 6～7加入水解粗酶搅拌混匀，30 ℃水浴保温24 h，过滤取清液，超滤并干燥[5]，得到自制壳寡糖Ⅰ；另取壳聚糖经上述酶解等步骤，但在干燥前纯化，得到自制壳寡糖Ⅱ。

1.3.2壳寡糖水溶性比较精密称取壳寡糖样品（简称样品）A、B和自制壳寡糖（简称自制）Ⅰ各100 mg，室温下分别加入1 mL 蒸馏水混匀，观察溶解情况；30 min后12 000r/min离心3 min，弃上清，沉淀置65 ℃烘箱干燥后称重，计算沉淀物占投入重量的百分比。

1.3.3壳寡糖的TLC分析取各样品的澄清溶液，在硅胶板上点样并展开，展开剂为正丁醇∶氨水=3∶1，茚三酮显色[6]。

1.3.4壳寡糖的HPLC分析取样品适量，Waters糖柱分析，流动相为乙腈∶水=50∶50（含3 ‰氨水），流速为1mL/min[7]。

1.3.5壳寡糖的质谱分析取样品适量进行质谱分析，离子源（200 Hz），反射式检测正离子[8]。

2结果

2.1壳寡糖外观及水溶性

制备得到白色粉末状壳寡糖，见图1。

样品A和B溶于水呈黄褐色混浊液；自制Ⅰ溶于水呈淡黄色透明澄清溶液。离心，沉淀烘干称重，计算沉淀物占投入重量的百分比：样品A为2.5 %，样品B为2.3 %，自制Ⅰ为0.1 %。

2.2壳寡糖的TLC结果

图2壳寡糖TLC层析图

本次薄层层析条件对壳寡糖的1糖～6糖斑点有最佳显示，7糖～9糖斑点的比移值小、分离度小。从薄层层析结果看，样品A和样品B斑点不明显，自制Ⅰ显示2糖～6糖斑点，自制Ⅱ显示3糖～6糖斑点。

2.3壳寡糖的HPLC结果

图3壳寡糖的HPLC重叠对比色谱图

本次液相色谱分析中流动相的组成保持不变，而随着壳寡糖聚合度逐渐增大，保留时间延长且峰型变钝。因此，此色谱图对壳寡糖系列的1糖～6糖显示最佳分析效果，7糖左右的寡糖则被展宽而只能显示出峰位置，10糖以上聚合度不能在本条件下显示出来。

从壳寡糖的HPLC重叠对比色谱图中看到，样品A显示2糖～7糖峰，样品B无峰，自制Ⅰ显示2糖～9糖峰，自制Ⅱ显示1糖～8糖峰。

从2糖～6糖段峰面积看，自制Ⅰ>自制Ⅱ>样品A>样品B；从7糖以上显示峰位看，自制Ⅰ显示7糖、8糖和9糖峰位，自制Ⅱ显示7糖和8糖，样品A显示7糖峰位，样品B无显示。

2.4壳寡糖的MALDI-TOF-MS结果

1,2,3,…：表示壳寡糖聚合度；(1,2,3,…)：表示含有几个乙酰基。

“通过精密同位素计算的壳寡糖相对分子质量”与“MALDI-TOF-MS图谱中的核质比”的差异产生在小数千分位标示――，在小数百分位标示――，在小数十分位无标示。

图4壳寡糖的MALDI-TOF-MS图谱

本次MALDI-TOF-MS检测了壳寡糖样品全组分，由于显示性局限，上述图谱只标注了相对基峰丰度较强的离子峰数据，所以能明确的是样品A主要含有聚合度为1，3，4，5的壳寡糖，自制Ⅰ主要含有聚合度为1～9的壳寡糖，自制Ⅱ主要含有聚合度为3，6，7，8，9的壳寡糖。

3讨论

由于缺乏标准壳4~9糖的系列对照品，本实验选用MALDI-TOF-MS提供的相对分子质量信息对壳寡糖产品定性。本次MALDI-TOF-MS提供的相对分子质量精确到小数点后第3位。与用同位素精密相对分子质量计算的壳寡糖相对分子质量相比，自制壳寡糖的比对差异主要产生于小数点后第2位，部分甚至产生在小数点后第3位。较之以前采用同种检测手段差异产生在“个位”而言是个进步，这样能更明晰、准确地定性自制壳寡糖的分子式和聚合度。本次MALDI-TOF-MS分析中选用的基质在0～400 m/z范围内会出现若干强峰，一般检测是不记录此段数据的。鉴于本次待测寡糖在此范围有分布，所以记录了此段数据；这样的结果是，计算机会自动选择“基质”产生的强峰为基峰，并规定为100 %强度，其他峰与之相比得到相应丰度。即如MALDI-TOF-MS图所示，所测壳寡糖的含量明显低于基质含量，这不代表真实壳寡糖含量也低，如有必要此分析软件可以继续放大以提供更多信息。

选用TLC定性的依据是：壳寡糖残基上的伯氨基遇茚三酮在加热条件下显红紫色；聚合度不同的寡糖在薄层展开显色后，呈现相对比移值渐变的一串斑点。壳寡糖中含有从原料壳聚糖带来的部分乙酰氨基残基，含该残基的寡糖与相同聚合度的不含乙酰氨基残基的寡糖的色谱行为略有差异，此薄层色谱上主要斑点的相对比移值也是有规律渐变的，因此能合理推断产品壳寡糖主要是由不带乙酰氨基的壳寡糖组成，这与原料壳聚糖较高的脱乙酰度是一致的。

HPLC提供的色谱峰没有达到基线分离，这可能是壳寡糖产品中少量的乙酰氨基壳寡糖的贡献[9]。通过氨基葡萄糖单糖定位，液质连用的分析，和已知的不同分布壳寡糖产品的比较，以及TLC提供的主要由不带乙酰氨基的壳寡糖组成的结论，能够基本判断各峰位代表的聚合度。由于不同聚合度壳寡糖对峰高或峰面积的贡献不一，目前还不能认定同一批产品内各聚合度壳寡糖所占相对比例，但能比较不同批次产品同一峰位的含量变化，从而指导优化生产。如果选用蒸法光散射检测系统，则能通过梯度洗脱在更宽的范围检测壳寡糖产品，了解更多聚合度分布的信息。

在多种检测方法的综合指导下看到，自制壳寡糖在聚合度1～9范围两边略有差异，这与各检测手段不同显示窗有关，但在聚合度6～8范围内的信息较一致。目前该工艺能够制备白色粉末状或者块状含有聚合度6～8的壳寡糖，适当纯化后能得到聚合度主要为6～8的壳寡糖；此制品在65 ℃下敞口烘烤24 h不变色，水溶性良好，有引湿性需在干燥环境保存。将来在原料选择、降解规律研究等方面还有很多工作要开展，这些将为进一步优化产品、简化工艺提供参考。

参考文献

[1]胡志鹏. 壳寡糖的研究进展[J]. 中国生化药物杂志，2003，24（4）：210-212.

[2]Se-Kwon K, Niranjan R. Enzymatic production and biological activities of chitosan oligosaccharides (COS): A review[J]. Carbohydr Polymers，2005，62（4）：357-368.

[3]Farooqahamed S K, Acharya B V K, Mandyam C V, et al. Chitooligosaccharides-preparation with the aid of pectinase isozyme from Aspergillus niger and their antibacterial activity[J]. Carbohydr Res, 2005, 340(6): 1239-1245.

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[5]张惟杰. 糖复合物生化研究技术[M]. 第2版. 杭州：浙江大学出版社，1999：120-126.

[6]Yeon J C, Eun J K, Zhe P, et al. Purification and Characterization of Chitosanase from Bacillus sp.Strain KCTC 0377BP and Its Application for the Production of Chitosan Oligosaccharides[J]. Appl Envir Microbiol, 2004, 70(8): 4522-4531.

[7]李曙光，白雪芳，杜昱光. 壳寡糖的分离分析及其诱抗活性研究[J]. 中国海洋药物，2002，21（6）：1-3.

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[9]纪莹，赵轶，周翔，等. 壳寡糖的制备及组分分析[J]. 中国现代应用药学，2003，20（3）：195-196.