精脒对CAOV3卵巢癌细胞端粒酶活性的影响

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【摘要】目的：探讨精脒对caov3卵巢癌细胞的生长和端粒酶活性的影响。方法：应用MTT法观察精脒对CAOV3卵巢癌细胞生长的影响，应用TRAP-银染色法检测精脒对CAOV3卵巢癌细胞端粒酶活性的影响。结果：在细胞培养过程中，外源性增加精脒浓度可使细胞生长速度加快。用不同浓度精脒室温处理的CAOV3细胞端粒酶提取液2小时后，端粒酶活性与对照组差异无显著性。CAOV3细胞经不同浓度精脒处理3天后的端粒酶活性与对照组相比明显增高。结论：精脒浓度的升高可引起端粒酶活性的增高，精脒引起的细胞增殖与端粒酶活性增高有关。

【关键词】端粒酶；精脒；TRAP；卵巢癌

文章编号：1009-5519（2007）15-2223-03 中图分类号：R33 文献标识码：A

Effect of spermidine on telomerase activity of CAOV3 cells

LIU Kun1，YAO Yang1，YU Cheng-guo2

（1.Department of Physiology，Shenyang Medical College， Shenyang 110034，China;2.Department of experimental equipment， China Medical University,Shenyang ，China）

【Abstract】Objective: To explore the effect of spermidine on the cell growth and the telomerase activity in CAOV3 cells. Methods: MTT assay was used to detect the effects of spermidine， and TRAP method was used to detect the telomerase activity in spermidine treating CAOV3 cells.Results:During cell growth， increase exogenous spermidine resulted in the increase rate of cell proliferation. Telomerase activity of CAOV3 cells' telomerase extraction treated with spermidine for 2 hours had no significant difference from the control group. Telomerase activity of CAVO3 cells treated with spermidine for 3 days significantly increased compared to the control group. Conclusion: Telomerase activity increased with the increasing of spermidine levels. Spermidine inducing cell proliferation was related to the telomerase activity increasing.

【Key words】Telomerase；Spermidine；TRAP；Ovarian cancer

多胺是一类广泛存在于生物体内天然脂肪族多价正离子，包括腐胺、精脒和精胺， 与细胞的增殖、分化、再生和肿瘤的恶化密切相关[1]。多胺不仅能促进正常细胞的生长，而且对恶性肿瘤细胞的增殖和转移起到促进作用。

端粒是真核生物线状染色体一种特殊结构，由一简单重复G的DNA序列及蛋白组成，人和各种脊椎动物端粒DNA序列均为（TTAGGG）n，端粒随细胞分裂而不断缩短至一定程度时，细胞将停止分裂，进入老化期，甚至死亡。因此，端粒在细胞衰老和肿瘤增殖中有重要作用。端粒酶的激活被认为是恶性肿瘤发生学上的一个共同途径[2]。端粒酶的活性受到各种因素的调节，多胺是否也是通过端粒酶激活这条途径而引起细胞增殖及肿瘤恶化的，是我们的研究所要解决的问题。

1 材料与方法

1.1 材料：CAOV3细胞系来源于中国医大细胞生物学实验室；PCR Kit；PBR322/HAVⅢ DNA mark（TaKaRa 公司）；二甲基亚砜(DMSO)；精脒（Sigma公司）；RPMI-1640培养基；小牛血清；引物：TS AAT CCG TCGAGCAGAGTT，CX CCCTTA CCCTTACCCTTACCCTAA（宝生物公司合成）。

1.2 方法

1.2.1 不同浓度精脒对CAOV3细胞系生长速度的影响：在37℃，5%CO2饱和湿度条件下，用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液培养CAOV3细胞系。取对数生长期细胞的103个细胞接种于96孔板中，24小时细胞贴壁后，分别加入10 μm、20 μm、30 μm、40 μm、50 μm、60 μm、70 μm、80 μm、90 μm、100 μm、200 μm、300 μm、400 μm、500 μm 600 μm、700 μm、800 μm、900 μm精脒各3孔，并设对照一组，MTT法连续5天测其生长曲线。

1.2.2 不同浓度精脒对CAOV3细胞提取液端粒酶活性的影响：取对数生长期的细胞104个接种于24孔板，培养3天，常规提取细胞DNA，在细胞DNA提取液中分别加入50 μm、70 μm、90 μm、100 μm、200 μm精脒室温作用2小时，用95%乙醇沉淀DNA除去精脒。

1.2.3 不同浓度精脒对CAOV3细胞系端粒酶活性的影响：50 μm、70 μm、90 μm、100 μm、200 μm的精脒处理细胞，并设对照一组，连续培养1天、3天、5天。收集细胞用PBS洗涤2次，300 g离心10分钟，加入裂解缓冲液，16 000 g离心30分钟，取上清-70℃冻存备用。

1.2.4 TRAP－银染法检测端粒酶活性：取DNA提取液PCR扩增：条件是94 ℃ 30秒，50 ℃ 30秒，72 ℃ 1分30秒，30个循环，最后72 ℃延长10分钟。酚氯仿抽提，乙醇沉淀，12%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，硝酸银染色，0.28 mmol/L Na2CO3溶液中显色，至出现清晰条带，用回收的10%冰醋酸固定液终止反应。

1.2.5 统计学分析：以各条带峰值总面积代表端粒酶活性，应用单因素方差分析分析实验结果。

2 结果

2.1 不同浓度精脒对CAOV3细胞系生长速度的影响：MTT法检测结果表明，外源性增加精脒浓度可使细胞生长速度加快。在检测的10~900 μm精脒浓度范围内，90 μm的外源性精脒是使细胞生长速度最快的浓度值。

2.2 不同浓度精脒对CAOV3细胞提取液端粒酶活性的影响：经精脒处理后的CAOV3细胞提取液端粒酶活性与对照组差异无显著性。以扫描仪分析各条带峰值总面积代表端粒酶活性，用50 μm、70 μm、90 μm、100 μm、200 μm精脒处理的CAOV3细胞提取液端粒酶活性分别是对照组的(103.1±3.5)%，(98.5±6.1)%，（106.8±2.4）%，（99.6±4.1）%，（101.9±5.2）%。

2.3 不同浓度精脒对CAOV3细胞系端粒酶活性的影响：经精脒处理后的CAOV3细胞端粒酶活性与对照组相比明显上调。以凝胶电泳分析系统分析，各条带峰值总面积代表端粒酶活性，用50 μm、70 μm、90 μm、100 μm、200 μm精脒处理3天的肿瘤细胞端粒酶活性分别是对照组的（97.5±2.7）%，（101.2±3.4）%,（157.3±6.3）%，（144.5±3.1）%，（150.5±6.5）%。

3 讨论

本研究用不同浓度精脒处理CAOV3细胞，观察细胞生长速度，在细胞培养过程中，外源性精脒浓度增加可使细胞生长速度加快，证明了多胺在肿瘤发生发展中的重要作用。外源性精脒对细胞生长具有促进作用，浓度在90 μm时作用最强。

文献报道多胺生物合成抑制可引起Hep-2细胞的增殖抑制同时伴有端粒酶活性的抑制，补充外源性多胺则端粒酶活性表达正常[3]。我们用外源性精脒作用于CAOV3细胞，检测到端粒酶活性增高，提示多胺引起肿瘤细胞的增殖与端粒酶激活密切相关。多胺能够结合带负电的大分子，如DNA、RNA、和蛋白质，通过影响染色体结构和与特异序列的DNA-或RNA-蛋白相互作用而发挥作用[4]。端粒酶的激活与许多调节途径有关，其中hTERT在端粒酶调节过程中的作用是最主要的[5]。多胺可能作用于端粒酶的hTERT活性区域，调节hTERT的转录而导致端粒酶的激活。可是精脒作用于CAOV3细胞提取液，未见其端粒酶活性与正常组织有明显差异，精脒作用于CAOV3细胞系可见端粒酶活性明显上调。这些实验结果不支持精脒直接作用于端粒酶的hTERT活性区域而调节端粒酶活性。多胺可能通过与细胞内其它生物活性物质结合间接的调节端粒酶活性。

一些研究表明，原癌基因c-fos、c-myc和c-jun的表达至少部分参与了因多胺刺激导致肠粘膜生长的早期调节。提高细胞多胺，在体内、体外诱导肠黏膜生长均会伴随着原癌基因的表达，而且会进一步诱导DNA合成[5，6]。而在端粒酶hTERT活性区包含E-boxes，是c-myc的结合位点。c-myc与Max蛋白形成异二聚体识别并激活hTERT转录活性[7]。还有研究结果表明用DFMO处理细胞，使其细胞内多胺耗竭，可使p53水平明显增高，并伴有p53蛋白浓度升高。用DFMO处理过的IEC-6肠上皮细胞系中p21、p27和 p53均有轻度增高。p53是端粒酶活性调节的重要因素之一，p53与Sp1形成复合物抑制Sp1与hTERT启动子结合，因而使hTERT转录下调，有效的抑制了端粒酶活性。这些结果表明多胺对端粒酶活性调节的作用可至少部分解释为原癌基因的激活，以及抑癌基因的表达抑制[8，9]。

另外，用精脒作用于CAOV3细胞系，3天可见到端粒酶活性明显上调，也提示精脒不是端粒酶活性调节的直接作用因素。

参考文献：

[1] Ake Sjoholm. Role polyamines in the regulation of proliferation and hormone production by insulin-secreting cells[J].Am J，Physiol，1993，264（3）:C501.

[2] Glilson E，Laroche T，Gasser SM. Telomeres and functional architec-ture of the nucleus[J]. Trends cell Biol，1993，3（2）:318.

[3] 李 原，范慕贞，曹淑兰，等.多胺生物合成抑制剂对Hep－2细胞生长及端粒酶活性影响的研究[J].中华耳鼻喉科杂志，2001，36（8）:261.

[4] Pollard KJ，Samuels ML，Crowley KA，et al. Functional interaction between GCN5 and polyamines: a new role for core histone acetyla-tion[J]. EMBO J，1999，18（36）: 5622.

[5] Takakura M，Kyo S，Kanaya T，et al. Cloning of human telomerase catalytic subunit (hTERT) gene promoter identification of proximal core promoter sequences essention for transcriptional activation in immortalized and cancer cells[J]. Cancer Res，1999，59（3）:551.

[6] Wang JY，Takeuchi K. Polyamines in gastrointestinal mucosal cell proliferation J[J]. Gastrointest Res，1996，4（1）: 86.

[7] Gunes C，Lichtsteiner S，Vasserot AP，et al. Expression of the hTERT gene is regulated at the level of transcriptional initiation and repressedby Mad1[J]. Cancer Res，2000，60（15）:2116.

[8] Xu D，Wang Q，Gruber A，et al. Downregulation of telomerase reverse transcriptase mRNA expression by wild type p53 in human tumor cells[J]. Oncogene，2000，19：5123.

[9] Kanaya T，Kyo S，Hamada K，et al. Adenoviral expression of p53 re-presses telomerase activity through down-regulation of human telom-erase reverse transcriptase transcription[J]. ClinCancerRes，2000，（4）：1239.

收稿日期：2007-04-11