白花蛇舌草LC-MS指纹图谱的研究

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[摘要]目的：建立白花蛇舌草的lc-ms指纹图谱。方法：采用LC-MS法，检测不同产地同一季节采收的10批样品色谱特征，与此同时和黄毛耳草（两者都属于茜草科耳草属植物）进行比较。结果：建立白花蛇舌草指纹图谱。结论：LC-MS指纹图谱具有特异性，可以评价和全面控制白花蛇舌草质量。

[关键词]白花蛇舌草；LC-MS；指纹图谱

[中图分类号]R927[文献标识码]A[文章编号]1673-7210（2007）02（b）-021-03

白花蛇舌草为茜草科一年生草本植物白花蛇舌草(Hedyotis diffusa Willd.)的带根全草，始载于《广西中药志》。具有清热解毒，利湿通淋之功效。临床上用于治疗扁桃体炎、咽喉炎、急慢性胆囊炎、尿路感染、菌痢、毒蛇咬伤、癌症等有显著的疗效[1,2]。

齐墩果酸、熊果酸和阿魏酸是白花蛇舌草的重要活性成分，前二者为同分异构体。具有抑菌、护肝、升白细胞 [3,4]等作用。阿魏酸具有抗氧化[5]和清除自由基、防癌等作用。然而，由于许多原因（如地理环境、培植、炮制方法等）会影响其化学成分、含量及临床疗效，因此，建立白花蛇舌草质控方法是非常必要的。我们采用LC-MS法，优化色谱质谱条件，检测不同产地样品的三种有机酸的含量，建立了白花蛇舌草的指纹图谱。 1 材

１材料与方法

2.1 仪器材料

LCMS-2010型液相色谱质谱联用仪（日本岛津），LC-10AD型双泵液相色谱，SPD-M10AVP型DAD检测器，7725i手动进样器，LCMS Solutions工作站。C18 （150×2.1 mm, 5 μm ）色谱柱 (美国Thermo Electron 公司)。流动相：甲醇-0.05%醋酸（表1）。流速：0.2 ml/min。柱温：45℃。注入量：5 μl。质谱APCI 400℃, CDL 250℃, BLOCK 250℃，正离子，扫描范围m/z 100～800。

2.2 试药和试剂

齐墩果酸对照品购自天津尖峰天然产物研发有限公司; 熊果酸对照品购自中国药品生物制品检定所，编号110742－200314;阿魏酸对照品购自中国药品生物制品检定所，编号0773－9910。纯度大于98%。

甲醇、乙腈为色谱纯购自美国Tedia公司，其他化学试剂如醋酸、乙醇均为分析纯。

2.3 药材

10批新鲜白花蛇舌草来自于同年9月的不同地区（表1）。它们均是白花蛇舌草带根全草。由湖南省中医药研究所彭荣贵研究员鉴定。将不同产地的样品60℃鼓风干燥2 h，粉碎研细并过40目筛，4℃贮存。

表1样品信息

1.4 对照品溶液制备

精密称取齐墩果酸、熊果酸、阿魏酸对照品适量 ,分别置于100 ml容量瓶中，甲醇溶解，定容至100 ml，摇匀，制成浓度分别为53 μg/ml、54 μg/ml及306 μg/ml的对照品贮备液，置于4℃保存备用。

1.5 供试品溶液制备

取样品粉末1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中加入甲醇40 ml，超声处理30 min，冷却，用甲醇补足失重，摇匀，静置，3000 r/min离心，15 min，取上清液用0.45 um的微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。

黄毛耳草溶液制备方法同上。

2 结果

2.1 流动相选择

对不同流动相进行比较如甲醇-水，甲醇-乙腈-水，乙腈-水。结果发现甲醇-0.05%醋酸最合适，齐墩果酸和熊果酸这两个同分异构体被分离。而用甲醇-水流动相这两个有机酸不能被分离。用甲醇-乙腈-水为流动相阿魏酸峰不理想。因此通过多次试验选择甲醇-0.05%醋酸作为流动相，65 min后无特征峰出现，故检测时间为65 min。梯度洗脱见表2。

2.2 方法学考察

2.2.1 精密度取同一批样品5 μl注入HPLC，连续进样5次，以熊果酸峰的保留时间和峰面积值为1，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积及其RSD值，共有峰相对保留时间RSD小于3%，相对峰面积RSD小于5%。同一批样品每天在同一时间进样，连续进样5 d，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积及其RSD值。共有峰相对保留时间RSD小于2%和相对峰面积RSD小于5%。结果显示良好日内、日间精密度。

2.2.2 稳定性取同上批号的样品5 μl，分别在0，6，12，18，24小时进样，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积及其RSD值。相对保留时间小于4%和相对峰面积小于5%。结果显示样品溶液24 h内稳定。

2.2.3 重复性取同上批号的供试品5份，分别进样，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积及其RSD值。相对保留时间小于3%和相对峰面积小于5%。结果显示重复性好。

2.3 指纹图谱

2.3.1 指纹图谱的建立分别吸取10批供试品各5 μl进样，得到11个共有峰（图1）。分别计算共有峰的相对保留时间和相对峰面积。相对保留时间小于3%（表3），非共有峰面积不到10%。黄毛耳草与白花蛇舌草同为茜草科耳草属，被用来作为阴性对照，在同样色谱条件下得到的指纹图谱与白花蛇舌草有很大差别。该指纹图谱可用于白花蛇舌草的质量控制。

保留时间（x±s,min）：1. 1.905±0.030;2. 8.438±0.196;3. 35.318±0.139;4. 38.297±0.049;5. 39.265±0.096;6. 41.634±0.101;7. 44.605±0.077;8. 53.009±0.291;9. 54.077±0.131;10. 58.159±0.194;11. 63.922±0.315

2.3.2 共有峰的归属共有峰1、8、9与三个对照品阿魏酸、齐墩果酸和熊果酸保留时间一致，且图2共有峰1号m/z为195[M+H]+；峰8号和9号的m/z均为439[M -H2O+ Na]+，这与阿魏酸、齐墩果酸、熊果酸的分子量分别为194，456，456相一致。样品峰与三个标准品的m/z结果相同。因而，这三个共有峰为阿魏酸、齐墩果酸、熊果酸。

2.3.3 指纹图谱分析采用SPSS软件，对10批白花蛇舌草的指纹图谱中各特征峰的相对峰面积进行聚类分析（Ward方法），聚类图见图3。样品被分为4类：[1,7,2,9],[4,10],[3,5,8]和 [6]。利用Excell软件，分别采用夹角余弦和相关系数作测度，计算所有样品的相似度。所有样品的相似度均大于0.9（表4）。说明了10批样品具有总体一致性。

3 讨论

指纹图谱技术是中草药及其制剂质量评价的有利工具[6]，早在上世纪90年代初WHO就推荐使用以评价草药质量。

我们通过液质联用建立了白花蛇舌草指纹图谱。通过分析m/z，可定量分析指纹图谱征性物质和共有峰归属。10批样品的指纹图谱基本相同，都包括11个共有峰，但与同属的黄毛耳草图谱比较有很大区别，因此指纹图谱能用于鉴别真伪。指纹图谱反映的是样品整体的特征，进行指纹图谱比较，可以反映样品之间的亲疏程度，但是单纯的直观比较指纹图谱的峰的多少和峰的大小，只是定性比较，而且又带有个人的主观性。聚类分析和相似度计算均为中药指纹图谱的计算机解析方法，可以定量地，客观地对样品进行评价。

图3和表4结果稍有差别，在图3中样品3，5，8非常相似，而表4样品5，8相似，但和3相差较远，这也说明不同统计方法的局限性。

因此，我们建立了白花蛇舌草的指纹图谱，该图谱可以应用于鉴定或控制白花蛇舌草的质量。

[参考文献]

[1]吴琼.白花蛇舌草的临床应用概况.中药材,2000,23(10):654-657.

[2]Yoshida Y,Wang MQ,Liu JN,et al.Immunomodulating activity of Chinese medicinal herbs and Oldenlandia diffusa in particular [J].Int J Immunopharmacol,1997,19:359-370.

[3]Jaime AR,Luis A,Guillermo SH.Oleanolic acid promotes healing of acetic acid-induced chronic gastric lesions in rats[J].Pharmacol Res, 2003,48:291-294.

[4]Hsu HY,Yang JJ,Lin CC.Effects of oleanolic acid and ursolic acid on inhibiting tumor growth and enhancing the recovery of hematopoietic system postirradiation in mice [J].Cancer Lett,1997,111:7-13.

[5]Bajpai M,Mishra A,Prakash D.Antioxidant and free radical scavenging activities of some leafy vegetables [J].Int J Food Sci Nutr,2005,56:473-81.

[6]Meng J,Leung KSY,Jiang ZH,et al.Establishment of HPLC-DAD-MS fingerprint of fresh Houttuynia cordata [J].Chem Pharm Bull,2005,53:

1604-1609.

（收稿日期：2007-01-12）

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