忍冬干叶基因组DNA提取方法的研究

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摘 要：目的：从变色硅胶干燥的忍冬叶片中提取高质量的基因组dna。方法：分别采用常规CTAB法与改良CTAB法提取干叶的DNA，通过琼脂糖凝胶电泳、紫外分光光度法、酶切检测其质量，并与鲜叶的提取效果比较。结果：改良CTAB法所得DNA优于常规CTAB法，电泳条带清晰，完整性好，纯度高，能被EcoRⅠ完全酶切。从变色硅胶干燥的忍冬叶片中提取的DNA质量与鲜叶无明显差异，且产率更高。结论：改良CTAB法适合忍冬干叶基因组DNA的提取。

关键词：忍冬干叶；DNA提取；改良CTAB法

中图分类号：R282

文献标识码：A

文章编号：1673-7717(2008)03-0496-03

A Study on Methods for Extraction of Genomic DNA from Lonicera JaponicaThunb. Dry Leaves

WANG Ting1，ZHOU Feng-qin1，LI Jia1， ZHANG Yong-qing1，GUO Qing-mei1，XIA Yang2，LI Yan-yan2，YAN Li-ping2

(1.College of Pharmacy，Shandong University of Chinese Medicine， Jinan 250014，Shandong，China；

2.Shandong Academy of Forestry Science，Jinan 250014，Shandong，China)

Abstract：Objective：To extracthigh quality genomic DNA from Lonicera JaponicaThunb.dry buds with silica gel. Methods：Two different methods，conventional CTAB method and modified CTAB method，were applied to isolate genomic DNA from dry leaves of Lonicera Japonica Thunb.The DNA obtained was analyzed by the means of agarose gel electrophoresis，ultraviolet spectrophotometric method and enzymatic digestion.Results：Higher purity DNA was obtained by modified CTAB method and it can be digested by restriction enzyme EcoRⅠcompletely. The DNA extracted from dry buds had no obviousdifferences with the DNA from fresh buds in quality and got higher yield. Conclusion：The modified CTAB method was suitable for the extraction of genomic DNA from Lonicera JaponicaThunb.dry leaves.

Keywords：Lonicera JaponicaThunb.dry leaves；DNA extraction；modified CTAB method

金银花为忍冬科植物忍冬Lonicera JaponicaThunb.的干燥花蕾或带初开的花[1]。山东是金银花的重要道地产区，长期的自然选择与人工选择，忍冬的种质发生了明显的变异与分化，形成了很多农家品种或品系[2]。为了综合评价忍冬的种质资源，有必要在分子水平上对其遗传多样性进行分析，而基因组DNA的成功抽提是进行任何分子生物学研究的前提。常用的植物DNA提取材料是新鲜幼嫩叶片，然而受取样时间、交通运输条件等的限制，鲜叶往往得不到较好的保存，严重影响了所提DNA质量和下游操作。文献报道[3-6]用变色硅胶快速干燥法保存的材料提取DNA效果较好，且采样方便，样品可长期保存。因此，笔者在进行忍冬种质评价的AFLP分析时，以变色硅胶干燥叶片为材料，进行基因组DNA提取方法的研究，摸索出了适合忍冬干叶的DNA提取方法，从而为后续的采样工作和DNA模板的制备奠定了良好的基础。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1实验材料 于2006年10月取自山东平邑，经山东中医药大学周凤琴教授鉴定为忍冬科植物忍冬Lonicera JaponicaThunb.。取新鲜完整叶片按文献[7]方法用变色硅胶脱水干燥，同时取枝条扦插，用其萌发的幼叶作对照。

1.1.2试剂琼脂糖(Biowest)；CTAB(Sangon)；EDTA、Tris(济南朋远生物技术有限公司)；β-巯基乙醇(济南爱博经贸有限公司)；PVP-40(北京欣经科生物技术公司)；EcoRⅠ，DNA Marker DL 2000，λ-HindⅢ digest(TaKaRa)；其余试剂均为国产分析纯。

STE核分离缓冲液：100mmol/LTris-HCl(pH 8.0)，50mmol/L EDTA(pH 8.0)，700mmol/LNaCl，2% PVP(w/v)，2%β-巯基乙醇(v/v)。2×CTAB提取缓冲液：2%(w/v)CTAB，100mmol/LTris-HCl(pH 8.0)，20mmol/L EDTA(pH 8.0)，1.4mol/LNaCl，5% PVP(w/v)，2%-巯基乙醇(v/v)。10%CTAB溶液：10%(w/v)CTAB，0.7mol/L NaCl。TE缓冲液：10 mmol/LTris-HCl(pH8.0)，1mmol/L EDTA(pH 8.0)。

1.1.3仪器AllegraTM21R Centrifuge 高速冷冻离心机(BECKMAN COULTER)；UV-2102 PC型紫外-可见分光光度计(UNICO)；DYY-12型电脑三恒多用电泳仪(北京市六一仪器厂)；紫外凝胶成像仪(SYNGENE)。

1.2方法

1.2.1 常规CTAB法参考文献[8]法。

1.2.2改良CTAB法参考文献[9]法并作适当修改。取干叶0.1g(鲜叶0.2g)于预冷研钵中，加液氮研成细粉后立即加入1mL STE核分离缓冲液，迅速研磨成匀浆，小心转入1.5mL离心管中。4℃ 4000r/min离心10min，弃上清。加入65℃预热的2×CTAB提取缓冲液600μL混匀，65℃水浴30min，期间轻缓摇动数次。水浴后冷却至室温，加入600μL氯仿/异戊醇(24：1)，轻轻颠倒混匀，12000r/min室温离心10min。取上清液至另一管中，加入1/10体积预热的10%CTAB溶液混匀，再加入等体积氯仿/异戊醇(24：1)，轻轻颠倒混匀，12000r/min室温离心10min。重复抽提1～2次，取上清，加入1/10体积3mol/L NaAC(pH5.2)混匀，再加入2倍体积预冷的无水乙醇，-20℃放置30min后可见白色丝絮状沉淀析出。用灭菌枪头将沉淀挑入一新离心管中，用1mL70%乙醇清洗两次，室温干燥后溶于200μLTE中，加入2μLRNase(10mg/mL)酶液37℃消化1h。加入等体积的氯仿/异戊醇(24：1)轻轻颠倒混匀，室温放置10min，12000r/min室温离心10min。取上清，加入1/10体积3mol/LNaAC(pH5.2)混匀，再加入2倍体积预冷的无水乙醇，-20℃放置30min。10000r/min室温离心10min，弃上清，沉淀用1mL70%乙醇洗两次，室温干燥后溶于适量TE中，-20℃保存备用。

1.3 DNA质量鉴定

1.3.1产率及纯度检测取3μL DNA样品稀释1000倍，在紫外分光光度计上测定260、280nm处的吸光度，根据OD260nm估算DNA产率，OD260nm/OD280nm的比值判断DNA纯度。

1.3.2 电泳检测取5μL DNA样品在1.0%的琼脂糖凝胶(含EB)上电泳，在SYNGENE型凝胶成像系统下观察、拍照，根据λ-HindⅢ digest判断基因组DNA的分子质量大小。

1.3.3 酶切检测20μL反应体系中，模板DNA500ng，限制性内切酶EcoRⅠ5U，10×H buffer 2μL，加ddH2O至20μL。37℃酶切3h，加入1/10体积10×Loading Buffer终止反应，1.5%琼脂糖凝胶(含EB)电泳检测酶切效果。

2结果与分析

2.1 产率及纯度检测

结果见表1。从外观上看，常规CTAB法所得干叶DNA沉淀为棕褐色至黑色，TE很难溶解，溶液呈棕黄色，且仍有不溶杂质。OD260nm/OD280nm在1.40～1.57之间，产率由于酚类等杂质污染无法精确计算。改良CTAB法所得干叶DNA粗提后有轻微褐变，进一步纯化后无色透明，OD260nm/OD280nm在1.75～1.90之间，SAS软件统计结果显示与鲜叶相比无明显差异，且产率更高，达180～220 μg/g，说明用改良CTAB法提取的干叶DNA纯度较高，蛋白质等杂质污染少。

2.2 电泳检测

从图1可以看出，常规CTAB法提取的干叶DNA点样孔中有强烈荧光，DNA与多糖等杂质形成复合物滞留在点样孔中；而改良CTAB法得到的DNA条带清晰明亮，RNA消化完全，无拖尾或弥散现象，点样孔周围也无明显荧光，与λ-HindⅢ digest对照，大小在23kb左右，说明所提DNA纯度和完整性较好。

图2为改良CTAB法提取的干叶与鲜叶DNA的电泳图谱。两种材料所提DNA无明显差异，均为整齐明亮的条带，其中鲜叶DNA带型更宽，可能与溶解时所用TE量较少而浓度较高有关。

2.3 酶切检测

图3为改良CTAB法提取的DNA经EcoRⅠ酶切后的图谱。从图3可以看出，干叶与鲜叶用改良CTAB法所得DNA均可被限制性内切酶彻底消化，在凝胶上呈现出相对分子质量由高向低的弥散状态，原来完整的基因组DNA条带消失，酶切完全，说明所提DNA纯度较好，能够用于酶切等对DNA质量要求较高的实验。

3讨 论

3.1实验材料的选择与处理

在进行忍冬的分子生物学研究时，如何进行野外采样是笔者首先遇到的难题。鲜样品所得DNA纯度高，污染少，但需将样品用液氮速冻或置冰盒中取回后低温保存，对于野外大规模采样并不适用。变色硅胶干燥法能使样品快速失水，操作方便，是一种较好的样品保存方式。因此笔者选取忍冬新鲜叶片，放入装有足量变色硅胶的自封口袋中，保证叶片与硅胶充分接触，并勤换硅胶，直至叶片彻底干燥。实践证明，这一样品处理方法取得了较好的效果。

3.2忍冬干叶不同提取方法的比较

忍冬叶片富含多糖、多酚等次生代谢产物，这些物质与DNA的不可逆结合会严重影响后续的酶切操作和Taq聚合酶的活性。CTAB法去除多糖效果较好，是最常用的植物DNA提取方法。因此笔者以忍冬干叶为材料，对常规CTAB法进行了以下改进：①用STE核分离缓冲液对样品进行预洗。②提取液中增加酚类络合剂PVP和抗氧化剂β-巯基乙醇的用量。③氯仿/异戊醇抽提时，中间加入10%CTAB除多糖。④用高浓度钠盐(1/10体积3 mol/L NaAC)和-20℃冷藏的无水乙醇沉淀DNA。结果显示通过以上改良CTAB法提取的DNA质量明显优于常规CTAB法。

3.3改良CTAB法提取不同材料的比较

为了进一步验证改良CTAB法所提干叶DNA的质量，笔者同时提取忍冬鲜叶的DNA作对照。结果显示干叶与鲜叶所提DNA的质量无明显差异，且干叶产率更高，可能与相同质量的材料干叶中含有的水分更少有关。说明通过适当处理与改进，干叶也可以作为提取DNA的较佳材料。

3.4结论

改良CTAB法提取的干叶DNA纯度高，完整性好，能够被完全酶切，在进行AFLP等对模板DNA质量要求较高的实验时，可作为提取忍冬基因组DNA的一种有效方法。

参考文献

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