盐酸左氧氟沙星注射液细菌内毒素检测方法的研究

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【摘要】 目的 探讨用凝胶法检查盐酸左氧氟沙星注射液中的细菌内毒素。方法 参照2010版《中国药典》细菌内毒素检查法，用不同厂家的鲎试剂对不同批号的注射用盐酸左氧氟沙星注射液分别进行干扰实验，探讨考察注射用盐酸左氧氟沙星注射液的细菌内毒素检查方法。结果 注射用盐酸左氧氟沙星注射液以消除对鲎试剂的干扰，用灵敏度0.25EU/ML的鲎试剂检测内毒素是有效的，与家兔法检测结果应一致。结论 初步认为注射用盐酸左氧氟沙星注射液可以用细菌内毒素法取代家兔法的热原检验

【关键词】 盐酸左氧氟沙星注射液；细菌内毒素检查法；干扰实验；鲎试剂

1 仪 器

恒温水浴锅，型号S648，上海医疗器械七厂；净化工作台，型号HS-1300，苏净集团安泰公司；漩涡混旋器，型号XW-80A，上海沪西分析仪器厂有限公司；微量取液器（50μl-250μl，上海金林生化试剂仪器厂）；无热原吸咀（250μl，湛江博康海洋生物有限公司）；试验所用玻璃仪器均经250℃干烤2h。

2 试剂与样品

2.1 试剂 鲎试剂（TAL），批号：11082712，灵敏度0.25EU/ml；批号：11032212，灵敏度0.25EU/ml。细菌内毒素工作标准品（CSE），批号：150601-201070，每支140EU。细菌内毒检查用水（BET水），批号：1111070。

2.2 样品 盐酸左氧氟沙星注射液，规格：100ml：0.2g；批号：13052239、13052240、13052241。

3 方法与结果

3.1 鲎试剂灵敏度复核[1] 用细菌内毒素检查用水将细菌内毒素工作标准品溶解，置旋涡混旋器上混合15min，然后制备成0.5、0.25、0.125、0.0625EU/ml的溶液，依据2010版《中国药典》二部附录ⅪE方法进行灵敏度复核实验，见表1。

表1结果表明，测得灵敏度λc均为0.25EU/ml，均在标示灵敏度λ的0.5-2.0倍之间，则各批鲎试剂灵敏度符合规定，可以用于细菌内毒素检查。

3.2 细菌内毒素限值（L）的确定[2] 注射用盐酸左氧氟沙星注射液临床使用剂量为一次规格100ml：0.2g，静脉滴注至少60分钟，则细菌内毒素限值（L）按公式L=K/M计算，式中K=5EU/kg・h、M=200mg/60kg・h，计算结果L=1.5EU/mg。根据以有的国家标准及就严不就松的原则，确定每1mg盐酸左氧氟沙星注射液中内毒素的限值为0.6EU。

3.3 最大有效稀释倍数（MVD） 根据已有的国家标准，规定每1mg盐酸左氧氟沙星注射液中内毒素的限值为0.6EU。目前市售鲎试剂灵敏度有0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03EU/ml五种规格，根据公式MCD=C・L/λ计算，式中C=2mg/ml，L=0.6EU/mg，λ=0.5-0.03EU/ml，计算结果最大有效稀释倍数（MVD）应为2.4-40倍，又所用鲎试剂灵敏度为0.25EU/ml，所以MVD=4.8。

3.4 细菌内毒素标准品的稀释（S） 用细菌内毒素检查用水将细菌内毒素标准品稀释成，0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03EU/ml系列浓度的内毒素溶液备用，作为Es系列。

3.5 供试品溶液的稀释 用细菌内毒素检查用水将盐酸左氧氟沙星注射液稀释成1（2mg/ml），2（1mg/ml），4（0.5mg/ml）倍系列浓度的溶液备用。

3.6 供试品的干扰初筛试验 用细菌内毒素检查用水将样品配制成1，2，4倍的系列溶液备用，记为SW系列；另在制备一份同样浓度的样品溶液，在制备中加入细菌内毒素，使每一浓度中含2λc浓度的内毒素，记为SE系列。选用2个批号的灵敏度为0.25EU/ml的鲎试剂分别与SW和SE系列溶液反应，相应得供试品阴性对照（NPC）和供试品阳性对照（PPC）系列，每一稀释浓度平行做2反应管，同时做阴性对照（NC）和阳性对照（PC），见表2。

3.7 干扰试验 将3批供试品用细菌内毒素检查用水稀释成2倍的溶液（1.0mg/ml）作为供试液，分别取供试液和细菌内毒素检查用水分别将细菌内毒素标准品稀释成0.5EU/ml（2λ）、0.25EU/ml（λ）、0.125EU/ml（0.5λ）、0.0625EU/ml（0.25λ）两个系列浓度，分别取0.1ml，加入到2个批号灵敏度为0.25EU/ml用0.1ml细菌内毒素检查用水溶解的鲎试剂中，每一浓度操作4支试管，另外，取供试品和细菌内毒素检查用水做2支阴性对照，进行反应（37±1℃）60±2min，见表3。

3.8 样品细菌内毒素检查 取注射用盐酸左氧氟沙星注射液3批，在细菌内毒素限值为0.6EU/mg下，用细菌内毒素检查用水稀释成2倍稀释溶液，每批取鲎试剂8支，每支加入0.1ml的细菌内毒素检查用水溶解，2支分别加入2倍稀释液0.1ml（供试品管）；2支分别加入0.1ml用细菌内毒素检查用水将细菌内毒素工作标准品制成的0.5EU/ml的内毒素溶液（阳性对照管）；2支分别加入0.1ml用盐酸左氧氟沙星注射液将同一支细菌内毒素工作标准品制成的0.5EU/ml的内毒素溶液（供试品阳性对照管）；最后2支分别加入0.1ml的细菌内毒素检查用水（阴性对照管），将试管轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入37±1℃恒温水预锅中，保温60±2min，轻轻取出观察，见表4。

4 讨 论

在供试品的最大稀释倍数MVD的计算中，MVD的理论值应该为4.8倍。而从供试品干扰初筛实验结果表明，在供试品稀释到2倍后对鲎试剂与细菌内毒素之间的反应已无干扰，因此，采用稀释2倍后的浓度的供试品做干扰实验。从干扰实验的结果，表明3批样品被稀释成1.0mg/ml的溶液，再与2个不同厂家的鲎试剂进行实验，均不干扰鲎试剂，而且3批供试品的细菌内毒素检查结果均合格，因此，初步认为可以采用浓度为1.0mg/ml的供试品溶液进行供试品的细菌内毒素检查。

参考文献

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（2010年版二部）[S].北京：化学工业出版社，2010.

[2] 黄清泉.药品细菌内毒素检查实验设计[J].中国药学杂志，1997，32（2）：72.