全天然丝胶蛋白质风味蛋白酶水解产物抗氧化性研究

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摘要：不同丝胶蛋白酶水解的短肽丝胶蛋白物去除羟基自由基和去超氧自由基的能力不同。本文比较了多种酶对全天然丝胶水解产物的抗氧能力。风味蛋白酶水解的全天然丝胶蛋白质清除羟基自由基能力达到40.5％，去除超氧自由基能力达到31.08％。风味蛋白酶水解最佳条件为风味蛋白酶浓度为0.1g／ml，反应温度为50℃，水解时间为2h溶液，pH为中性，丝胶蛋白浓度为0.1g／ml，抗氧化能力最强，为食品、化妆品、医药功能及医学生物材料等的研发提供良好的依据。

关键词：全丝胶蚕品种　风味蛋白酶　抗氧化能力

自由基引发氧化作用，人体体外发生氧化，光和空气容易产生活性氧化酶和促进酪氨酸活性化活性，使皮肤发皱、产生斑点、变黑老化、引发皮肤癌变的可能。人体皮肤体内发生氧化，由于活性氧化酶作用，会引起精神紧张、心累、苦痛、寒冷、感染等极其普遍的刺激，而产生身体机能的变化，与癌、动脉硬化、糖尿病等具有密切关系。人类的食品发生氧化，人体本身是产生活性氧化酶和促进酪氨酸活性化活性的良好环境，食品的氧化是酶的褐变和黑色素的积累过程，使食品变质，营养破坏，导致一系列的食品制造、安全保鲜、营养吸收等恶劣后果。各种自由基所引发的氧化作用，是导致身体中各组织和器官损伤、病变的重要原因之一。人的衰老、动脉硬化、心脏病、肿瘤、肾病、肝病、糖尿病、白内障等近百种疾病的发生和发展均与自由基所引发氧化有关。

诸多专家研究结果说明丝胶蛋白质本身不具有去除自由基的作用，而丝胶蛋白质水解物对去除羟基、超氧自由基的能力较强。但不同水解酶的短肽丝胶蛋白物的抗氧化能力不同，水解条件也较大程度影响抗氧化能力。本文对多种水解酶对全天然丝胶蛋白质的抗氧能力的结果进行比较，认为风味蛋白酶水解的全天然丝胶蛋白质抗氧化能力较强；对风味蛋白酶水解的条件进行了统计分析，认为风味蛋白酶浓度为0.1g／ml，反应温度为50℃，水解时间为2h溶液，pH为中性，丝胶蛋白浓度为0.1g／ml，抗氧化能力最强。为食品、化妆品、医药功能及医学生物材料等的研发提供良好的依据。

一　材料与方法

1　供试材料

1.1　供试品种蚕茧壳

全由安徽省农业科学院蚕桑研究所提供天然白丝胶品种“白S”。

1.2供试丝胶蛋白质

丝胶溶解、浓缩、干燥方法参照叶崇军方法获得

2　试验方法

供试丝胶蛋白质天然白丝胶品种“白s”茧壳的溶解、浓缩、干燥，参照叶崇军…方法获得。

2.2清除羟自由基(・OH)能力测定方法

2.1不同蛋白酶水解丝胶蛋白抗氧化能力比较

设置在加酶量、底物浓度、反应温度、反应时间、pH同等条件下，对风味蛋白酶、动物蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶水解液作为样品溶液进行去除羟基自由基的比较实验。酶的灭活条件为100℃水煮10min。

取0.562g丝胶蛋白溶于5.62ml蒸馏水，配成0.1g／ml的丝胶蛋白溶液；各取0.2g动物蛋白酶，木瓜蛋白酶，风味蛋白酶，碱性蛋白酶，中性蛋白酶溶于2ml蒸馏水中，调制PH为7.0。取1ml蛋白质溶液加入0.02ml酶液，调制pH值中性，50℃下反应2h。

用FeSO4+H2O2产生－OH，以－OH氧化水杨酸钠所得产物的吸光值表示－OH的多少，吸光值越大，－OH越多。反应试管中加入0.5 m19 mmol／L FeSO4、0.5m19 mmol／1水杨酸－乙醇及0.5ml不同蛋白酶水解过的丝胶蛋白溶液，最后加入10mmol／1H202 5 ml启动反应，37℃温浴1h，于536nm处测吸光值。

清除率(％)=[A3-(A1－A2)]／A3×100

式中：A3为对照，不加样品；

A1为某浓度时的吸光值；

A2为无显色剂FeSO4时的该浓度的本底值。

2.2风味蛋白酶去除羟自由基(・OH)的条件优选

分别配制2mg／ml，4mg／ml，6mg／mL,8mg／ml，10mg／ml，12mg／ml,14mg／ml的丝胶蛋白溶液；配制1mg／ml的风味蛋白酶溶液。各取1.5ml不同浓度的丝胶蛋白溶液然后分别加入0.03ml，0.06ml，0.09ml，0.12ml，0.15ml，0.18ml，0.21ml的1mg／ml的风味酶液反应时间分别设置为1、2、3h。按照正交方案实验。

清除超氧自由基(・02－)能力

采用邻苯三酚自氧化法进行测定。取0.05mol／ITris－HCI缓冲液(Ph8.2)4ml，置于25℃水浴中预热20min，分别加入经过风味蛋白酶水解过的不同浓度的待测液2ml和25mmol／1邻苯三酚溶液1ml，混匀后于25℃水浴中反应5min，加入8％的HC10.1ml终止反应，在320nm处测吸光度(A)，以1ml蒸馏水作空白代替待测液作空白试验。

清除率(％)=[A3－(A1－A2)]／A3×100

式中：A1－某浓度提取液的吸光值；

A2-不加入邻苯三酚无显色时的吸光值；

A3-不加丝胶蛋白短肽的吸光值。

二　结果与分析

2.1不同蛋白酶水解丝胶蛋白抗氧化能力比较

不同的酶水解丝胶蛋白后所产生的短肽抗氧化能力不同，本实验采用单因素实验，在反应时间均为2h的条件下调查了不同的酶水解丝胶蛋白后清除・OH的能力，结果如图1所示。由表可以看出，风味蛋白酶水解丝胶蛋白后其清除OH的能力最强。

2.2风味蛋白酶水解的丝胶蛋白清除-OH的条件的优化

影响风味蛋白酶水解丝胶蛋白程度的因素主要有风味酶与蛋白的浓度比以及水解时间，本实验通过正交

试验分析了风味蛋白酶浓度、丝胶蛋白质浓度和水解时间的对・OH清除的最佳条件。

F0.05(2，4)=6.94，F0.01(2，4)=18.00

各因素的F值，A高度显著，B显著，即酶和蛋白浓度对实验结果影响高度显著，反应时间对实验结果影响显著。根据K值选择最佳浓度比(酶：蛋白)为1：100，最佳反应时间为2h。

2.3风味蛋白酶水解“白s”丝胶蛋白质清除的羟基自由基(・OH)能力

图2表明在风味蛋白质浓度为0.1g／ml条件下，不同浓度的丝胶样品均有一定的清除羟基自由基(・OH)能力，随着丝胶蛋白浓度的增加，其清除羟基自由基(・OH)能力逐渐增大，浓度为10mg／ml时清除能力最大，达到40.5％。当浓度大干10mg／m1时其对羟自由基的清除率开始降低。

2.味蛋白酶水解“白s”丝胶蛋白质清除超氧自由基(・02－)能力

图3表明，不同浓度的丝胶样品均具有一定的清除・O2－能力，其清除能力均随样品浓度的增大而增强，呈现一定的量效关系。当丝胶浓度达到10mg／ml时，清除能力达到31.08％。

三　结论

3.1风味蛋白酶通过内切方式切断多肽内部的肽键，形成短链肽，其中一些含有疏水氨基酸，使用外切酶每一次从多肽链的末端切断释放一个氨基酸，从而长链蛋白质水解为氨基酸。本文比较多种蛋白酶相对抗氧化活力，以水解物中风味蛋白酶水解物的相对抗氧化活力最大，与多篇论文的结论一致，说明风味蛋白酶不仅对植物蛋白水解物抗氧化性强，对动物蛋白水解也具有同样的作用。

3.2风味蛋白酶与丝胶蛋白浓度的配比、反应时间对羟基自由基的去除能力影响显著。最佳浓度比(酶：蛋白)为1：100，最佳反应时间为2h。对清除超氧自由基的条件优化需要进一步探讨。原因是浓度过低，清除反应不充分，浓度过高，对反应产生抑制作用。

3.3“白S”是全天然丝胶品种，可以通过蚕的饲育大量获得，具有强烈的羟基、超氧自由基清除能力，是保健品、化妆品等的优良原料和添加剂。