两种芽孢杆菌降解大豆油特性研究和比较

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摘 要 本研究采用实验室分离筛选出的两株降油菌株地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆，通过含油废水的生物除油条件实验表明，地衣芽孢杆菌降解大豆油的最佳条件为：菌体接种量为10%，2 ml/L的油浓度，pH值为9.2，37℃250rpm。在此条件下，大豆油的平均降解率可达96.09%。而枯草芽孢杆菌降解大豆油的最佳条件为：菌株的接种量为8%，2ml/L的油浓度，pH值为7.2，30℃ 200rpm。在此条件下，大豆油的平均降解率可达80.1%。经过实验证明地衣芽孢杆菌在最佳除油条件下，对大豆油的降解率远远大于枯草芽孢杆菌。

关键词 大豆油；降解率；地衣芽孢杆菌；枯草芽孢杆菌

中图分类号：S182 文献标识码：A 文章编号：1671-7597（2014）13-0047-03

随着人民生活水平的提高以及工业餐饮业的发展，排放在水体中的油脂含量日益增高。含油废水污染范围广，对人类和生态环境危害性大，油污染严重时还会直接导致水生动物的窒息死亡[1]。油的漂移和扩散，也会荒废海滩和海滨旅游区，造成极大的环境危害和社会危害，更重要的是废水中石油含有致癌烃，被鱼、贝富集并通过食物链危害人体健康。随着人民对环保的日趋重视，对含油废水的处理显得越来越重要[2]。对于含油废水的处理，人们采用了不同方法，如物理法有筛滤、沉淀、隔油等，化学法有絮凝、吸附、电解等，这些方法一般投资大、流程复杂、且化学方法会产生二次污染。相比之下，微生物能利用油脂作为生长的碳源和能源，使之水解成甘油和脂肪酸，最终降解为水和CO2等代谢产物，此法成本低、无二次污染，同时微生物降解油脂还具有来源广泛、选用便利、操作简单等优点[3]。据文献[4]报道，从油田集油站污染土壤中分离出的枯草芽孢杆菌能够降解原油，而且降解率达到34.3%。同时也有研究[5]表明从餐厅隔油池废水分离得到的芽孢杆菌经鉴定可以降解油脂，降解率达到97.3%。因此，本实验为了探讨两种芽孢杆菌的除油条件和降解特性，进行了以下研究。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1）菌种。地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）由实验室分离筛选，编号为AM-1。

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）由实验室分离筛选，编号为AM-2。

AM-1和AM-2种子培养基用液体LB进行培养，取单菌落中一定量菌种在LB斜面培养基上划线，置于37℃恒温箱培养12h，然后置于4℃的冰箱内保存。

2）实验用大豆油。本实验采用市售的金龙鱼精炼一级大豆油。原料产国阿根廷，出厂日期2012-3-9，制造商益海（广州）粮油有限公司，121℃，灭菌20 min待用。

3）培养基。

LB培养基：蛋白胨10 g/L、酵母膏 5 g/L、NaCl 10 g/L、初始pH值为7.2，121℃，灭菌20min。

无机盐培养基：（NH4）2SO4 0.5 g/L、NaCl 0.5 g/L、MgSO4・7H2O 0.2 g/L、CaCl2 0.05 g/L、K2HPO4 0.3 g/L、初始pH 7.2，121℃，灭菌20 min。

待测培养基：为了考察所筛选菌株除油效果，故需模拟实际废水的状况，以自来水中加入少量的无机盐即可较准确的满足实际废水状况的要求。待测培养基即为无机培养基加入大

豆油：

（NH4）2SO4 0.5 g/L、NaCl 0.5 g/L、MgSO4・7H2O 0.2 g/L、CaCl2 0.05 g/L、K2HPO4 0.3 g/L、大豆油 2 ml/L、初始pH 7.2。

1.2 实验测试方法

1）种子培养液的制备。将菌株AM-1和AM-2从斜面菌种中用接种环挑取一定量菌种分别接入两个装有50 ml LB液体培养基的250 ml三角瓶中，置于37℃ 200rpm的摇床中培养10-12 h。

2）菌种浓度测定。菌体浓度的测定采用分光光度法，取1 ml菌液稀释到10 ml，在600 nm的波长下以对照的无机培养基为空白测出吸光值。

3）大豆油降解率的测定。样品为加入菌液的待测培养基，空白为未加入菌液的待测培养基，分别用25 ml石油醚萃取，用分液漏斗分液，取上层于50 ml的大比色管中，再分别取400 μL于25 ml小比色管中石油醚定溶到10 ml，采用紫外分光光度计在215 nm波长下测量大豆油石油醚萃取液的OD值，计算大豆油降解率（除油率用百分比来表示）。

大豆油的降解率：

1.3 降解大豆油条件优化实验研究

1.3.1 不同接种量对大豆油降解率的影响

6个250 ml的三角瓶分别加入50 ml、49 ml、48 ml、

47 ml、46 ml和45 ml的无机培养基，调节pH值为7.2，加入

0.5 ml 5g/L CaCl2储备液，100 μL的大豆油，分别加入

0 ml、1 ml、2 ml、3 ml、4 ml和5 ml的种子培养液。将培养瓶放入37℃ 200rpm的摇床中培养120 h（即5天）。

1.3.2 不同油浓度对除油率的影响

取10个250 ml的三角瓶，5个空白加入50 ml的待测培养基，其他5个样品均加入等量的无机培养基，调节pH值为7.2，加入0.5 ml 5g/L CaCl2储备液，分别加入油量为25 μL、

50 μL、75 μL、100 μL和125 μL，每个油浓度均对应一个空白和一个样品，其中空白不加种子培养液，样品加入1.3.1的最佳除油效果接种量的种子培养液量。将培养瓶放入37℃ 200rpm的摇床中培养120 h（即5天）。

1.3.3 不同pH值对大豆油降解率的影响

取6个250 ml的三角瓶，其中一个为空白加入50 ml的待测培养基，pH值调至7.2，其他5个为样品均加入46 ml的待测培养基，pH值分别为5.2、6.2、7.2、8.2和9.2，加入0.5 ml 5g/L CaCl2储备液，加入1.3.2中最佳除油效果的油浓度，其中空白不加种子培养液，样品加入1.3.1的最佳除油效果接种量的种子培养液量。将培养瓶放入37℃ 200rpm的摇床中培养120 h（即5天）。

1.3.4 不同温度对大豆油降解率的影响

取10个250 ml的三角瓶，其中5个空白加入50 ml的待测培养基，其他5个为样品均加入46 ml的待测培养基，pH值调至1.3.3最佳除油效果的pH，加入0.5 ml 5g/L CaCl2储备液，加入1.3.2最佳除油效果的油浓度，其中空白不加种子培养液，样品加入1.3.1的最佳除油效果的接种量的种子培养液量。将培养瓶放入转速为200rpm温度分别为25℃、30℃、35℃、37℃和45℃的摇床中培养120 h（即5天），每一个温度设一个样品和空白。

1.3.5 不同摇床转速（溶氧）对大豆油降解率的影响

取10个250 ml的三角瓶，其中5个空白加入50 ml的待测培养基，其他5个为样品均加入46 ml的待测培养基，pH值调至1.3.3最佳除油效果的pH，加入0.5 ml 5 g/L CaCl2储备液，加入1.3.2最佳除油效果的油浓度，其中空白不加种子培养液，样品加入1.3.1最佳除油效果的接种量的种子培养液量。将培养瓶放入温度为1.3.4除油效果最佳的温度，转速分别设为100rpm、150rpm、200rpm、250rpm和280rpm的摇床中培养120 h（即5天），每一个转速设一个样品和空白。

1.4 最优条件下的除油效果验证

在上述实验得出的最优条件下进行平行实验，设置20个培养瓶进行平行实验，培养120h（即5天），计算大豆油的降解率，求出平均降解率。

2 结果与讨论

1）不同接种量对大豆油降解率的影响。菌株AM-1当接种量在2%到10%之间时，除油率随接种量的增加而升高，当接种量在10%以上时，降解率反而呈现下降趋势（图1），菌株AM-1接种量为10%时除油效果最佳；而菌株AM-2当接种量在2%到8%之间时，除油率随接种量的增加而升高，当接种量在10%以上时，降解率反而呈现下降趋势（图2），菌株AM-2接种量为8%时除油效果最佳。可见，两个菌株都不是菌体数目越多对降解越有利。虽然菌体的密度增加，但是在无机培养基中接入的有机质也越大，能抑制菌体的除油酶的生成，因此除油率也有所下降。

图1 菌株AM-1不同接种量对菌体生长和大豆油降解的影响

图2 菌株AM-2不同接种量对菌体生长和大豆油降解的影响

2）不同油浓度对大豆油降解率的影响。大豆油在该实验中作为碳源，油浓度不同即C：N比不同。菌株AM-1随着含油量的增加，降解率呈现逐渐减小的趋势，当大豆油浓度在2 ml/L以下时菌液OD600随着大豆油浓度的增加而增加，浓度超过2 ml/L时，OD600开始降低（图3）；而菌株AM-2在0.5 ml/L、1.0 ml/L、1.5 ml/L、2.0 ml/L的油浓度的范围内，菌种浓度OD600值和除油率随着油浓度的增加而增加，油浓度超过之后便呈下降的趋势（图4）。也就是两种细菌在油浓度大于2.0 ml/L时生长都受到了抑制，说明高的油浓度对细菌的生长有毒害作用。

图3 菌株AM-1不同投油量对菌体生长和大豆油降解率的影响

图4 菌株AM-2不同投油量对菌体生长和大豆油降解率的影响

3）不同pH值对大豆油降解率的影响。如图5，菌株AM-1对pH适应性比较强，在初始pH值5.2-9.2范围内均能正常生长和降解大豆油，降解率都在80%以上，但初始pH值为9.2时对大豆油的降解率最高；菌株AM-2在pH值=5.2-7.2之间的除油率和菌体浓度随着pH值的增加而增加，当pH值高于7.2时，AM-2的除油率和菌体生长情况随着pH值的增加而下降，因此pH=7.2为菌体生长的最佳pH值（图6）。

图5 菌株AM-1不同PH值对菌体生长和大豆油降解率的影响

图6 菌株AM-2不同PH值对菌体生长和大豆油降解率的影响

4）不同温度对大豆油降解率的影响。培养温度不同，同一菌株对油的降解率明显不同。如图7，菌株AM-1在25℃时菌液的OD值和对大豆油的降解率都比较低，降解率仅为41.94%，随着温度的升高，细菌代谢旺盛，在37℃时除油率达到90.50%的最高值；如图8，菌株AM-2在30℃时对大豆油的代谢作用最强，除油率达到80.1%的最高值。

图7 菌株AM-1不同温度对菌体生长和大豆油降解率的影响

图8 菌株AM-2不同温度对菌体生长和大豆油降解率的影响

5）不同摇床转速（溶氧）对大豆油降解率的影响。对于菌株AM-1，当摇床转速n≤250rpm时，大豆油的降解率随着摇床转速的增加而迅速增加，摇床转速为250rpm时的降解率最大，达到97.78%，而当摇床转速增大到300rpm时，降解率反而降低（图9）；当转速为200rpm时，菌株AM-2的除油率为最大值，菌体生长最旺盛，因为转速越大溶解氧就越大，但是在250rpm和280rpm这两个较高转速的条件下，菌体受到的剪切力也很大，所以菌体的除油率和菌体浓度没有随着转速的增加而增大，反而减小（图10）。

图9 菌株AM-1不同摇床转速对菌体生长和大豆油降解率的影响

图10 菌株AM-2不同摇床转速对菌体生长和大豆油降解率的影响

3 结论

通过优化影响菌株降解大豆油的各种外界因素，分别得到菌株AM-1和AM-2最佳降解大豆油的条件和大豆油的平均降解率。地衣芽孢杆菌AM-1降解大豆油的最优条件为：接种浓度为10%，2 ml/L的油浓度，初始pH值为9.2，温度为37℃，摇床转速为250rpm。在该条件下，大豆油的平均降解率可达96.09%；枯草芽孢杆菌AM-2的降解大豆油的最优条件为：接种浓度为8%，2 ml/L的油浓度，初始pH值为7.2，温度为30℃，摇床转速为200rpm。在该条件下，大豆油的平均降解率可达80.1%。微生物用来降解大豆油，治理环境污染有着美好的应用前景。

同时实验证明，在芽孢杆菌降解大豆油时，地衣芽孢杆菌的平均降解率明显大于枯草芽孢杆菌的降解率，但是地衣芽孢杆菌的接种浓度，初始pH值，培养温度和摇床转速要求都比枯草芽孢杆菌的要求要高。这为以后进行更深一层的实验和往更佳的条件研究提供了数据支持。

参考文献

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