痹痛方镇痛抗炎作用研究
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摘要：目的：观察痹痛方镇痛抗炎方面药效学作用，探讨其治疗类风湿性关节炎的药理学基础。方法：镇痛实验用热板法与扭体法；抗炎实验采用毛细血管通透性实验、棉球肉芽肿实验及佐剂性关节炎模型；观察药物对内毒素引起的TNF-α产生的影响。结果：在热板法与扭体法实验中痹痛方能明显提高小鼠痛阈；具有抑制毛细血管通透性、减轻棉球肉芽肿质量；显著抑制大鼠佐剂性关节炎急性足爪肿胀，对继发性的足肿胀也有明显的抑制作用。并能明显减少内毒素引起的TNF-α产生。结论：痹痛方具有明显镇痛抗炎作用。镇痛作用机制可能通过外周与中枢两种机制介导；而免疫调节作用可能为其抗风湿炎症的机制之一。
关键词：痹痛方；类风湿性关节炎；镇痛；抗炎；肿瘤环死因子
中图分类号：R285.5
文献标识码：A
文章编号：1673-7717（2007）04-0788-03
痹痛方多年来在临床主要用于治疗类风湿性关节炎，具有一定的临床疗效。主要由全蝎、蜈蚣、制附子、川芎、延胡索、芍药、丹皮等组成，具有搜风通络、行气止痛等功效。本试验利用弗氏完全佐剂诱导的大鼠佐剂性关节炎（Adjuvant Arthritis, AA）等模型，从动物实验角度对痹痛方的镇痛抗炎作用进行药效学评价。
1材料与方法
1.1实验动物与试剂NIH小鼠，普通级，BW（20±1）g，雌雄兼用；SD大鼠，普通级，BW（200±5）g，雄性，均由广东省医学实验动物中心提供。盐酸布洛芬（ibuprofen中美史克）、醋酸泼尼松片(prednisone，仙居制药)，弗氏完全佐剂（GIBCOBRL）。脂多糖(lipololysaccharide,LPS,from Escherichia coli0111:B4 Sigma)。TNF-α ELISA测试盒（RND）。痹痛方为院内制剂，由中药饮片水提浓缩而成，实验中用蒸溜水配成所需浓度。小剂量每mL含0.3g生药，大剂量每mL含0.6g生药。本研究中小鼠实验给药20mL/kg体重、大鼠给药10mL/kg体重。
1.2小鼠热板实验[1]NIH小鼠置于（55±0.5）℃的水浴烧杯上，以舔后足所需时间为痛阈(s)，各组动物均测两次给药前的正常阈值，取平均值为基线，剔除基线阈值在30s以上、阈值10s以内以及跳跃的小鼠。然后分组给药。对照组给等容积蒸馏水，小剂量组给0.3g/mL痹痛方20mL/kg；大剂量组给0.6g/mL痹痛方20mL/kg，西药组灌胃给盐酸布诺芬0.0105g/kg，给药后30、60、90、120min分别测各组小鼠的痛阈，如小鼠在热板上60s仍无痛反应，取出按60s计。
1.3小鼠扭体实验[2] NIH小鼠分别给等容积蒸馏水、小剂量中药、大剂量中药及盐酸布诺芬（0.0105 g/kg），给药后0.5 h，每只小鼠腹腔注射0.6%醋酸0.2mL，观察注射后20min内各鼠的扭体反应次数。
1.4小鼠腹腔毛细血管通透性实验[3]NIH小鼠同上给药0.5h后尾静脉注射0.5%伊文斯蓝生理盐水溶液10mL/kg BW，随即腹腔注射0.6%醋酸10mL/kgBW，20min后脱颈椎处死，剪开腹部皮肤肌肉，用6mL生理盐水分数次洗涤腹腔，吸管吸出洗涤液、合并后加入生理盐水至10mL，3000r/min离心15min；取上清液于590nm比色测定OD值。
1.5大鼠棉球肉芽肿实验[3]SD大鼠雄性，乙醚麻醉左侧腹股沟皮下切口，植入灭菌棉球30mg，分组连续给药7天（对照组每天给予等容积水，小剂量组给0.3g/mL痹痛方10mL/kg，大剂量组给0.6g/mL痹痛方10mL/kg，西药组给醋酸泼尼松片0.005g/kg），8天颈椎脱臼处死，取出棉球在60℃烘箱放置12h称重，减去原棉球重量即为肉芽肿净重。
1.6佐剂关节炎实验[4]SD大鼠，测左、右足容积，取均值作为给药前容积，右后足跖皮内注射弗氏完全佐剂0.1mL，对照组不注射佐剂。每天各组动物给予相应受试药物，对照组与模型组每天给予等容积水，小剂量组给0.3g/mL痹痛方10mL/kg，大剂量组给0.6g/mL痹痛方10mL/kg，西药组给醋酸泼尼松片0.005g/kg。动物每天给药1次，连续30天。给予佐剂后2、5、10、15、20、25、30天测右足容积1次，并于第10天起加测左足容积。足肿胀度计算方法：肿胀度（%）=（致炎后足容积-致炎前足容积）/致炎前足容积。
1.7内毒素诱导佐剂关节炎大鼠TNF-α产生[5]上述佐剂关节炎实验第30天，每只大鼠给予腹腔注射100μg/kg脂多糖(lipololysaccharide, LPS, from Escherichia coli0111:B4，生理盐水配制)，3h后，采血ELISA法测血浆TNF-α水平。
1.8统计学分析所有数据用mean±SD表达。用SPSS 11.0软件进行t检验，P
2结果
2.1热板法小鼠给予药物后30 min、60 min、90 min痛阈明显提高，与蒸馏水对照组比较差异有显著性（P
2.2扭体法小鼠给予药物后，对于醋酸化学因素导致的20 min扭体反应数量明显减少，与蒸馏水对照组比较差异有显著性（P
2.3小鼠腹腔毛细血管通透性实验痹痛方小、大两个剂量均能明显抑制小鼠的腹腔毛细胞血管通透性，与对照组比较差异具有显著性（P
2.4棉球肉芽肿实验痹痛方小、大两个剂量组大鼠由棉球引起的肉芽肿重量较对照组明显减少（P
2.5佐剂关节炎实验大鼠在注射弗氏完全佐剂后，注射足于第2天起出现明显肿胀，右足容积明显大于对照组（P
2.6内毒素诱导佐剂关节炎大鼠TNF-α产生佐剂关节炎模型大鼠在给予内毒素后，血浆TNF-α水平明显升高到（1737±317）pg/mL，高于对照组（593±144）pg/mL（P
3讨论
临床使用表明痹痛方具有镇痛抗炎治疗类风湿性关节炎的作用，因此药效学研究主要针对类风湿性关节炎的主要症状，如痛疼、炎症等，为临床使用该方治疗类风湿性关节炎及其症状提供适当的科学依据。
热板法温度刺激与腹腔注射有害化学品分别用于检测中枢与外周镇痛活性，醋酸引起痛疼与内源性物质释放兴奋痛觉神经末稍有关，研究结果表明痹痛方大小两个剂量在热板法与扭体法两个实验中均表现出镇痛作用，效应低于布诺芬。表明该复方的镇痛作用机制可能通过外周与中枢两种机制介导，这为该复方的临床镇痛效应提供药理学基础。在毛细血管渗透性实验与棉球肉芽肿实验中，痹痛方均表现出良好的抗炎作用，表示该复方对急慢性炎症具有抑制作用。弗氏完全佐剂诱导的关节炎实验中，每天灌胃给药，痹痛方两个剂量对佐剂注射足掌的急慢性炎症均表现出很好的抑制作用；对左足迟发性关节肿胀也有显著抑制作用，结果表明痹痛方对关节炎的发生发展有防治作用。
TNF-α是具有多种效应的细胞因子，在急性与慢性炎症均担当关键角色[6]，尤其在关节的炎症与损伤中起重要作用，具有促进炎症、刺激其它炎症因子的产生以及促进白细胞趋化等多种效应[7]。内毒素诱导的关节炎大鼠产生TNF-α等细胞因子常被用于评估抗类风湿性关节炎药物的免疫调节作用。在关节炎大鼠中，其对内毒素引起的TNF-α上升明显高于正常大鼠[5]。而此研究中痹痛方表现出抑制TNF-α产生，因此痹痛方下调TNF-α水平的免疫调节活性可能是其治疗类风湿性关节炎的机制之一。
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