氨溴索增强左氧氟沙星在铜绿假单胞菌生物被膜形成时的杀菌作用

开篇：润墨网以专业的文秘视角，为您筛选了一篇氨溴索增强左氧氟沙星在铜绿假单胞菌生物被膜形成时的杀菌作用范文，如需获取更多写作素材，在线客服老师一对一协助。欢迎您的阅读与分享！

【摘要】目的 观察盐酸氨溴索（AMB）对铜绿假单胞菌（P.a）的生物被摸（BF）破坏清除作用及其与左氧氟沙星（LFX）联合后对BF内P.a的影响。方法 分别建立PAO1的3 d和7 d体外BF模型，随机（随机数字法）分为空白对照组、AMB组，AMB+LFX组。AMB质量浓度分别为256 μg/ml和512 μg/ml。于体外早期和成熟BF模型形成后，分别加入不同质量浓度的AMB，作用24 h后，连续稀释法行载体表面BF内P.a活菌计数，SEM观察载体表面BF形态学变化； 采用单因素方差分析法（One-Way ANOVA）进行计量资料的统计分析。结果 无论是早期BF还是成熟期BF，药物作用24 h后SEM观察，AMB组载体表面BF较空白对照组明显减少，并且随着AMB质量浓度的增加，载体表面BF呈减少趋势。无论是早期BF还是成熟期BF，1 μg/ml的 LFX组可以减少BF内细菌（P

【关键词】铜绿假单胞菌；生物被膜；盐酸氨溴索；左氧氟沙星；杀菌作用

Ambroxol reinforce the bactericidal effect of levofloxacin on the Pseudomonas aeruginosa biofilm KONG Jin-liang， CAI Shuang-qi， CHEN Yi-qiang， YAN Ping， ZHANG Dong-wei， JIAN Li-juan，WU Hai-ying. Department of Respiratory Medicine， The First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University， Nanning 530021，China

Corresponding author：CHEN Yi-qiang，Email：

【Abstract】Objective To observe the destructive and scavenging effect of ambroxol（AMB）on the biofilm（BF） of Pseudomonas aeruginosa （P.a）. To evaluate the synergistically bactericidal effect of AMB along with levofloxacin （LFX）on BF of P.a.Methods The early model （cultured for 3 d） and mature model （cultured for 7 d） of P.a wild strain （PAO1） BF were established， in vitro， respectively. The models were randomly（random number）divided into control group， AMB group and AMB+LFX group. The concentrations of AMB were 256 μg/ml and 512 μg/ml， respectively. When the early BF model and mature BF model were made， different concentrations of AMB were added in AMB group and AMB+LFX （1 μg/ml） was added in AMB+LFX group. The number of viable P.a on the BF carrier was counted with the continuous dilution method 24 h after AMB or/and LFX added. Then， the BF morphological changes on the carrier surface were observed by using scanning electron microscopy （SEM）. Measured data were analyzed with single factor analysis of variance（One-Way ANOVA）. Results Both in the early BF model and in the mature BF model， the SEM examination showed that the BF in AMB group was significantly reduced compared to the control group， and this reduction of BF was in dose-dependent manner. LFX 1 μg/ml could reduce the number of viable bacterial in BF in both early model and mature model （P

【Key words】Pseudomonas aeruginosa；Biofilm；Ambroxol；Levofloxacin；Bactericidal effect

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa， P.a）是院内感染和致命感染的最常见病原菌，它可引起一系列急性和慢性感染[1]。P.a有多种生存策略，最主要的是能形成生物被膜（biofilm，BF）。Zhao和Liu[2]报道化痰药N-乙酰半胱氨酸可以抑制细菌在物体表面的黏附，减少和预防形成BF，显示出BF抑制剂的特性。盐酸氨溴索（ambroxol， AMB）是临床广泛应用于各科的药物之一，有溶解粘蛋白、抗炎和抗氧化作用[3]，其作用机制和N-乙酰半胱氨酸有相似之处。但是，对BF的作用，目前还不完全清楚。本研究针对这一问题进行了探讨。

1 材料与方法

1.1 材料

载体为医用输液管（截为10 mm，备用）。实验菌株为P.a野生株PAO1（由丹麦哥本哈根大学临床微生物研究室提供）；ATCC 27853（广西医科大学第一附属医院微生物室提供）。培养基及药物：LB（Luria-Bertani）（Sigma公司）；盐酸氨溴索（批号：100599-200502，中国药品生物制品检验所）；左氧氟沙星（LFX，批号：130537-200301，中国药品生物制品检验所）。仪器：恒温摇晃培养箱（中国科学院武汉科学仪器厂）；SPX型智能生化培养箱（宁波江南仪器厂）；台式低温高速离心机（5410R，德国Eppendof）；超声震荡清洗机[B-2500 S-MTH 必能信超声（上海）有限公司]；扫描电镜（S-800日本）。

1.2 方法

1.2.1 药物对PAO1最低抑菌浓度（MIC）的测定 试管二倍稀释法测定LFX和AMB对实验菌株PAO1野生株的MIC，同时平行测定其对质控菌株ATCC 27853的MIC作质量控制。敏感性分类和质量控制均采用美国临床检验标准委员会推荐标准。

1.2.2 生物被膜体外模型的制备 细菌BF的制备：按文献[4]方法，采用输液管为载体进行BF 的培养。取隔夜培养的含有PAO 1 的肉汤， 比浊仪调定为0.5麦氏单位， 吸取0.1 ml菌液种入到含有4.9 ml LB液及10 mm输液管载体的24孔板中， 37 ℃培养， 隔日更换LB液，培养3 d得到早期BF，培养7 d 得到成熟BF。

1.2.3 扫描电镜标本的处理与观察 将输液管在2.5%戊二醛中固定，PBS中漂洗，梯度乙醇脱水，真空喷镀金粉。观察与摄片条件： 电压20 kV ，放大倍数：3750。

1.2.4 P.a 的BF内存活菌菌落计数 取出输液管载体，10 ml生理盐水冲洗载体表面的浮游菌，然后放入加有2 ml无菌生理盐水的小试管中，超声震荡10 min脱膜，涡旋1 min使菌液充分混匀。连续稀释法进行载体表面活菌计数计算细菌浓度，然后换算输液管细菌计数的常用对数。结果用均数±标准差（x±s）表示，每次测定均重复测3 次计算平均值。

1.2.5 AMB和LFX联合用药方法 分别设置空白对照组、LFX组、以及LFX+AMB组，每组6份载体。LFX终质量浓度为1 μg/ml，AMB终质量浓度分别为256 μg/ml、512 μg/ml。空白对照组使用无菌生理盐水。将上述各组药物加入24孔培养板中，每孔液体为2 ml。将附有早期或者成熟BF的输液管经无菌生理盐水充分漂洗后放入各孔中，37 ℃孵育24 h。

1.3 统计学方法

采用SPSS for windows 13.0 统计软件进行分析处理。采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P

2 结果

2.1 药物最低抑菌质量浓度（MIC）的测定结果

LFX对PAO1及ATCC27853的MIC均为0.5 μg/ml。AMB对PAO1及ATCC27853的MIC均为2048 μg/ml。

2.2 AMB对BF的破坏作用的SEM观察结果

早期或者成熟的BF，经过和512 μg/ml的氨溴索作用24 h以后，发现载体表面早期BF可以见大量聚集成堆的菌体，菌体表面黏液样物质明显减少。成熟BF中菌体轮廓模糊，被黏液样物质包绕，但仍可见游离细菌，黏液样物质变稀薄。如图1。

2.3 AMB与LFX联用对BF内P.a的影响

在建立体外P.a早期和成熟的BF，用LFX和不同质量浓度的AMB在37 ℃联合作用24 h后，进行BF内活菌计数，见表1。统计分析结果显示，不论是早期BF，还是成熟期BF，单独使用LFX时，其载体BF内活菌计数和空白对照组差异具有统计学意义（P

3 讨论

P.a可以引起急性或慢性感染，增加了发病率和病死率。形成BF是P.a对抗生素耐药的重要方式之一。当其生长条件恶劣时，P.a形成BF附着于周围的无生命物质或者机体组织， 这是P.a为了适应环境、维持自身生存所发生的适应性变化。一旦形成BF，抗生素即使剂量增加数倍，仍难凑效。故在P.a导致的慢性难治性感染中，BF高度耐药与BF结构有密切关系[5]。细菌BF中，胞外多糖纤维或多糖-蛋白质复合体纠缠在一起并交错成立体网状，间隙内充满了带有负电荷的藻酸盐，形成黏稠致密的黏液样物质，它们构成细菌生长的外环境，形成坚固的弥散屏障，阻碍了抗生素的渗透和弥散[5]。在这种状态下，抗菌药物只能杀灭表层细菌，而无法以有效浓度渗透至深部细菌之中，成为慢性感染的重要原因。

有研究发现14、15元环大环内酯类[6]抗生素和磷霉素[7]等可以破坏已经形成的BF，并与其他抗生素对BF内细菌有协同杀菌作用；中草药金银花、黄芩对BF的破坏作用等[4，8]也逐渐引起人们的关注。

本研究发现，早期或者成熟BF，经512 μg/ml AMB作用24 h以后，载体表面BF均有不同程度的减少，部分被清除破坏，以早期BF的变化明显。说明一定质量浓度的AMB可破坏BF的形态结构，使其变得稀疏，从而增加抗生素的渗透，增加BF内P.a接触到的抗生素量。随后笔者进行的AMB和LFX的联合实验表明，BF经LFX与不同质量浓度AMB联合作用后，载体BF内P.a均较LFX单独使用时减少（P

参考文献

[1]Deep A， Chaudhary U， Gupta V. Quorum sensing and bacterial pathogenicity： from molecules to disease[J]. J Lab Physicians，2011， 3（1）：4-11.

[2] Zhao T， Liu Y. N-acetylcysteine inhibit biofilms produced by Pseudomonas aeruginosa[J].BMC Microbiol，2010， 10：140.

[3] Malerba M， Ragnoli B. Ambroxol in the 21st century： pharmacological and clinical update[J]. Expert Opin Drug Metab Toxicol， 2008，4（8）：1119-1129.

[4] 孔晋亮，陈一强，闫萍，等. 黄芩水煎液对铜绿假单胞菌生物被膜清除作用的体外研究[J]. 中华结核和呼吸杂志， 2006，29（5）：347-348.

[5] Rybtke MT， Jensen P?，H?iby N， et al. The implication of Pseudomonas aeruginosa biofilms in infections[J]. Inflamm Allergy Drug Targets，2011， 10（2）：141-157.

[6] Tré-Hardy M， Nagant C， El Manssouri N， et al. Efficacy of the combination of tobramycin and a macrolide in an in vitro Pseudomonas aeruginosa mature biofilm model[J]. Antimicrob Agents Chemother，2010， 54（10）：4409-4415.

[7] Cai Y， Fan Y， Wang R， et al. Synergistic effects of aminoglycosides and fosfomycin on Pseudomonas aeruginosa in vitro and biofilm infections in a rat model[J]. J Antimicrob Chemother，2009， 64（3）：563-566.

[8] 陈一强，覃雪军，朱莲娜，等. 金银花水煎液及联合头孢他啶对铜绿假单胞菌生物膜的体外影响[J]. 中华微生物学和免疫学杂志， 2004，24（9）：738-742.

（收稿日期：2012-04-27）

DOI：10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2012.11.011

基金项目：国家自然科学基金（30760084）；广西壮族自治区卫生厅基金课题（Z2010334）；广西壮族自治区中医药管理局基金课题（gzzc1138）；广西壮族自治区教育厅课题（桂教201106LX092）；本研究获得广西大型仪器网测试补助

作者单位：530021 南宁，广西医科大学第一附属医院呼吸内科（张东伟现工作于广西柳州市人民医院呼吸内科）

通信作者：陈一强，Email：

中华急诊医学杂志2012年11月第21卷第11期Chin J Emerg Med，November 2012，Vol.21，No.11

P1230-P1233