黑青稞籽皮类黄酮的提取及其对缺氧损伤细胞的保护作用

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[摘要] 目的 探讨不同缺氧损伤细胞模型下黑青稞籽皮类黄酮物质对缺氧损伤细胞的保护作用。 方法 采用柠檬酸-乙醇浸提法富集黑青稞籽皮类黄酮物质，并对类黄酮含量进行两种不同方法检测和定量，用三种不同的细胞模型验证其对缺氧损伤的保护作用。 结果 实验条件下得到黑青稞籽皮提取物30.3 mg/g，通过光谱分析及HPLC检测发现，籽皮中的类黄酮物质多为花青素类，花青素提取率为68.6 mg/g，其中氯化花翠素占提取物的57 mg/g；以芦丁标定类黄酮总量达到69.4 mg/g；实验所用剂量条件下，黑青稞籽皮类黄酮表现出了对三种缺氧损伤细胞的保护作用，并能有效清除活性氧自由基，提高过氧化物歧化酶的活性。 结论 黑青稞籽皮提取物发挥缺氧损伤保护作用的物质基础可能是花青素类黄酮，它对防护活性氧介导的细胞损伤具有重要意义。

[关键词] 黑青稞籽皮；类黄酮；缺氧；细胞损伤；保护作用

[中图分类号] R284 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2014）07（c）-0090-05

类黄酮（flavonoids）又称生物类黄酮，是植物光合作用产生的一类重要的天然有机化合物，基本母核为2-苯基色原酮类化合物，现在则泛指两个具有酚羟基的苯环通过中央三碳原子相互连接的一系列化合物（图1）。类黄酮可进一步分为：黄酮醇类、黄酮类或黄碱素类、黄烷酮类、黄烷醇类、花青素类、原花青素类、异黄酮类等。类黄酮具有多种多样的生物活性和药理作用，对一些常见病和多发病有重要的治疗或预防作用[1-2]。

类黄酮的提取是根据相似相溶原理，影响类黄酮提取的控制因素是类黄酮在所选用溶剂中的溶解度大小以及向溶剂扩散的难易程度[3]。根据黑青稞籽皮特点，本研究选用乙醇浸提法进行了黑青稞籽皮类黄酮的提取，提取物进行了相关检测，对类黄酮进行了定量，确定了黑青稞籽皮类黄酮物质主要为花青素类黄酮，应用实验室建立的三种细胞缺氧损伤模型，验证对缺氧损伤保护作用的有效性。

1 仪器与试药

1.1 主要仪器

BeckmanDU640紫外/可见分光光度计（德国Beckman公司）；光学显微镜（重庆光学显微镜XDS-1B）；磁力搅拌器（上海司乐仪器厂81-2）；RE-52型旋转真空蒸发器、SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵（上海亚荣生化仪器厂）；洁净操作台（北京冠鹏净化设备有限公司）；光学显微镜（重庆光学显微镜XDS-1B）；荧光显微镜（Leica，DMI 4000B）；水平离心机（Anke TDL-50B）；CO2恒温培养箱（Thermo，3111）；电子称量天平（Sartoruis BSA124S-CW）；pH计（HANNA）。

1.2 主要试剂

化矢车菊素、矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、花青素鼠李葡糖苷、矢车菊素-3，5-二氧葡萄糖苷、氯化花翠素、氯化花葵素、天竺葵素-3-氧-葡萄糖苷、锦葵色素等标准品，购于Sigma公司；芦丁标准品，购于中国药品生物制品检定所；无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠均为国产分析纯，国药集团化学试剂公司生产。DMEM培养基（Gibco）、胎牛血清（Hyclone）、HEPES（Amresco）、DMSO（Amresco）；活性氧检测试剂盒（编号S0033）（碧云天生物技术研究所）；总SOD活性检测试剂盒（编号S0107）（碧云天生物技术研究所）。

2 方法与结果

2.1 黑青稞籽皮类黄酮的提取工艺

黑青稞籽皮50%乙醇浸提（条件：0.2%柠檬酸调pH=2；53℃水浴3 h；溶剂：料10∶1）醇提液减压回收提取物常温干燥类黄酮提取物。

2.2花青素的定量

本研究应用一般花青素提取率的测定方法进行了检测和计算，方法如下：取“2.1”项下黑青稞籽皮提取物用50%乙醇溶解，以提取试剂作为空白，于535 nm处测定吸光度值，按照下列公式进行计算：花青素含量（μg/g）=A535×V×N×1000/98.2×m，式中；A535为535 nm处的吸光度；V为稀释后的体积（mL）；N为稀释倍数；1000为单位换算倍数（mg/gμg/g）；98.2为花青素的平均消光系数；m为样品重量（g）。

2.3 类黄酮物质的定量

2.3.1 芦丁标准曲线制作 精密称取经120℃烘干至恒重的芦丁标准品20 mg，用60%乙醇溶解定容至100 mL，摇匀，得0.2 mg/mL的芦丁标准溶液。分别精密量取0.2 mg/mL芦丁标准溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL置于25 mL容量瓶中，各加60%乙醇溶液至5 mL，再加1.0 mL 5%的亚硝酸钠溶液，摇匀，静置6 min，加10%硝酸铝溶液1.0 mL，摇匀，静置6 min，加入10 mL的4%氢氧化钠，再用60%乙醇定容至刻度， 摇匀，放置15 min后，以试剂空白作参比，于510 nm波长处测定其吸光度。

2.3.2 黑青稞籽皮提取物中类黄酮的含量测定 精密称取待测样品200 mg，用60%乙醇溶解定容至100 mL，摇匀，得2 mg/mL的样品溶液，分别精密量取2 mg/mL样品溶液4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 mL置于25 mL容量瓶中，各加60%乙醇溶液至8 mL，再加1.0 mL 5%的亚硝酸钠溶液，摇匀，静置6 min，加10%硝酸铝溶液1.0 mL，摇匀，静置6 min，加入10 mL的4%氢氧化钠，再用60%乙醇定容至刻度，摇匀，放置15 min后，以试剂空白作参比，于510 nm波长处测定其吸光度。以芦丁标准曲线标定样品中的类黄酮含量。

2.4 提取物对心肌损伤细胞保护作用

2.4.1 心肌细胞培养 H9c2细胞置于含有15%胎牛血清的高糖DMEM培养液中，在37℃，5%CO2条件下培养。细胞生长至80%～85%后，0.25%胰蛋白酶消化，取对数生长期细胞进行实验。

2.4.2 过氧化氢（H2O2）损伤心肌细胞模型 配制细胞损伤液：30%的H2O2用DMEM稀释成0.03% H2O2溶液；配制终浓度为100 mg/mL的黑青稞籽皮提取物溶液，稀释配制成6.25、12.5、25 μg/mL三个剂量组。空白对照组加入含15%血清的正常培养基，损伤对照组和治疗组加入损伤液，每孔100 μL；H2O2损伤10 min，吸出损伤液，空白对照组和损伤对照组加入含血清的正常培养基，给药组分别加入6.25、12.5、25 μg/mL的黑青稞籽皮提取物溶液，每孔100 μL，将96孔板放入37℃，5%CO2培养箱中继续培养18 h，进行MTT检测。

2.4.3 百草枯（PQ）损伤心肌细胞模型 称取1.03 mg PQ溶解到10 mL含15%血清的培养基中，得到400 μmol/L的PQ溶液，配制终浓度为100 mg/mL的黑青稞籽皮提取物溶液，稀释分别配制成6.25、12.5、25 μg/mL三个剂量组；空白对照组加入含15%血清的正常培养基，损伤对照组和治疗组加入损伤液，每孔100 μL；PQ损伤18 h，吸出损伤液，空白对照和损伤对照组加入含血清的正常培养基，给药组分别加入6.25、12.5、25 μg/mL的黑青稞籽皮提取物溶液，每孔100 μL，将96孔板放入37℃，5%CO2培养箱中继续培养18 h，进行MTT检测。

2.4.4 连二亚硫酸钠（Na2S2O4）损伤心肌细胞模型 Na2S2O4溶于低糖DMEM中，配成终浓度为5 mmol/L Na2S2O4缺氧液。正常的细胞培养液吸出，PBS洗涤两次后换上缺氧液，置于常规培养箱内20 min，造成细胞缺氧。分别取正常培养的H9C2细胞随机分为五组：正常对照组、缺氧组、黑青稞籽皮提取物15.6、31.2、62.5 μg/mL组。将96孔板放入37℃，5%CO2培养箱中继续培养12 h，进行MTT检测。

2.4.5 细胞内活性氧（ROS）检测 按照试剂盒要求处理各组细胞，消化收集后，PBS洗涤1次。加入用低糖DMEM稀释的2′，7′-二氯氢化荧光素二酯（DCFH-DA）800 μL（终浓度为10 μmol/L），置于37℃孵育20 min。PBS洗涤细胞两次，立即上机，激发波长488 nm，发射波长525 nm检测各组细胞荧光强度。

2.4.6 细胞内过氧化物歧化酶（SOD）检测 按照总SOD活性检测试剂盒要求处理各组细胞，消化收集后，PBS洗涤1次。离心，沉淀用裂解液裂解，4℃离心取上清，按照样品测定要求制备待测样品和其他溶液，置于37℃孵育20 min，在560 nm处测定吸光度。按照公式计算酶活：待测样品中SOD酶活力单位=检测体系中SOD酶活力单位=抑制百分率/（1-抑制百分率）单位。

2.4.7 MTT检测 每孔加入10 μL MTT溶液，放入培养箱中继续孵育4 h；每孔加入100 μL SDS，再放入培养箱中孵育12 h；酶标仪读数OD570值。

2.5 统计学方法

采用统计软件SPSS 19.0对实验数据进行分析，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，多组间两两比较采用LSD-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2.6 提取物的检测

从8 kg的黑青稞中得到籽皮提取物242.46 g，得率为3.03%。对提取物进行了全波长扫描，发现在500～540 nm附近和275 nm附近有吸收峰，判断提取物含有花青素类黄酮。结果见图2。

2.7 花青素定量

按照“2.1”项下方法提取工艺提取了三批黑青稞籽皮，按照花青素提取率公式经计算，花青素提取率平均值为6.86%。

2.8 芦丁标准曲线

以吸光度为纵坐标（Y），芦丁标准溶液的质量浓度（mg/mL）为横坐标（X）绘制标准曲线，其线性回归方程为：Y = 11.349X-0.0039，r = 0.9996，标准曲线见图3。

2.9类黄酮的含量测定

按照芦丁的标准曲线线性范围，选择5个样品浓度，进行了检测，从结果来看，类黄酮含量均在线性范围内，平均值为6.94%。见表1。

2.10 提取物的HPLC检测

经军事医学科学院仪器测试分析中心检测和定量，在黑青稞籽皮提取物中存在矢车菊素-3-O-葡萄糖苷（0.49%）、花青素鼠李葡糖苷（0.42%）、氯化花翠素（5.7%）、天竺葵素-3-氧-葡萄糖苷（0.27%）和锦葵色素（0.21%）。见图4。

2.11 提取物对心肌细胞（H2C9）损伤的保护作用

实验结果表明，黑青稞籽皮提取物在实验所用剂量下对H2O2、PQ、Na2S2O4三种化学试剂导致的细胞损伤均显示出了保护作用，提取物在25 μg/mL条件下，表现出对H2O2损伤的保护作用；提取物在12.5 μg/mL条件下，开始表现出对PQ损伤的保护作用；提取物在31.2 μg/mL条件下，开始表现出对Na2S2O4损伤的保护作用。见图5。

2.12 提取物对SOD和ROS的影响

对SOD和ROS的检测，结果显示提取物在150 μg和300 μg剂量下能有效提高SOD活性和减少ROS水平，说明提取物可提高SOD活性清除氧自由基发挥对损伤细胞的保护作用。结果见图6、7。

3 讨论

本研究通过实验筛选，确定了实验室条件下黑青稞籽皮的最佳提取工艺，得到了稳定的类黄酮提取率，为黑青稞籽皮类黄酮开发耐缺氧功能食品制定质量标准提供了可靠方法和数据。应用了不同的类黄酮检测方法对黑青稞籽皮提取物进行了检测和定量，从得到的结果来看，花青素与类黄酮含量检测基本一致，黑青稞籽皮提取物中的类黄酮物质主要是花青素类，用自然界天然存在的八种花色苷标准品（氯化矢车菊素、矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、花青素鼠李葡糖苷、矢车菊素-3，5-二氧葡萄糖苷、氯化花翠素、氯化花葵素、天竺葵素-3-氧-葡萄糖苷和锦葵色素）进行了检测和比对，发现存在氯化花翠素（5.7%）和锦葵色素（0.21%）花青素类物质，氯化花翠素是黑青稞籽皮含量最多的，同时存在矢车菊素-3-O-葡萄糖苷（0.49%）、花青素鼠李葡糖苷（0.42%）、天竺葵素-3-氧-葡萄糖苷（0.27%）等花色苷物质。目前笔者应用Sephadex LH20凝胶柱层析对提取物进行了进一步的纯化和分离，获得了8个单体成分，正在进行鉴定和分析，为明确提取物提供有效线索。

在植物中花青素与各种单糖通常以糖苷键结合生成糖基化成衍生物-花色苷，花青素和花色苷的抗氧化活性除可预防癌症、心血管和神经性疾病外[4]，还有保护肝脏[5]以及预防糖尿病[6]、减肥[7]、保护视力等[8-9]许多功效。不同的植物中的花青素种类、含量不尽相同，如蓝莓主要的花青素为矢车菊素、飞燕草素、矮牵牛素、芍药素、锦葵花素[10]，紫薯中的花青素主要为芍药素和矢车菊素两种[11]。这些不同与植物生长的环境息息相关，研究表明[12-13]，光质、光强、低温、干旱均影响花色苷的形成，光照越强，花色素苷积累越多；且蓝光、紫外光是促进花色素苷合成的最有效光质，低温和干旱均利于花色苷的合成。生长在高原环境、长期高强度紫外线照射、低温、干旱条件下黑青稞籽皮富集了大量的花青素类黄酮，环境的影响赋予了类黄酮更多的生物学活性和生理功能[14-15]。

笔者在小鼠药效学实验中发现，黑青稞籽皮提取物具有提高缺氧耐受力和抗疲劳的作用，为了研究发挥耐缺氧作用机制，本研究选择了三种不同的细胞损伤模型进行了相关实验，结果表明，提取物对缺氧损伤细胞模型表现出了不同的保护作用，过氧化氢和百草枯损伤都是由于产生的大量氧自由基对大鼠心肌细胞（H9C2）造成损伤，不同在于过氧化氢属于急性损伤、百草枯主要是慢性损伤，因此二者在制造细胞损伤模型时，处理时间不同；连二亚硫酸钠通过制造缺氧微环境对H9C2细胞进行损伤。在本研究中笔者发现，黑青稞籽皮提取物可以抑制心肌细胞凋亡，稳定线粒体膜电位，抑制ROS产生，提高SOD活性，促进抑凋亡蛋白Bcl-2的表达，提高磷酸化的Akt活性，推测对心肌的保护作用可能与Bcl-2/Bax调控和激活PI3K-Akt信号通路有关，相关机制研究工作继续深入进行。

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（收稿日期：2014-04-09 本文编辑：卫 轲）