白芨在食管标本磁共振成像中的作用
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[摘要] 目的 探讨碘油（加白芨）在磁共振上的信号特点。 方法 制备样品：碘油样品取自肝栓塞剂的碘化油，并各取12 mL泛影葡胺、3‰和10‰釓对比剂置试管内作为对照。将试管按顺序排列，于0.35T的MR仪进行多参数扫描；计算SNR值进行对比。 结果 碘油在体外DWI序列上呈低信号，STIR上呈较低信号。 结论 可以用DWI和STRI来区分碘油，判断碘油的沉积情况，同时显示肿瘤的信号。
[关键词] 磁共振成像；脂肪抑制序列；扩散加权成像
[中图分类号] R445.2 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2013）18-0070-03
食管癌是全世界癌症死亡的第七大原因，最有效的治疗方法是手术，但是要在最早阶段才会有好的效果，目前5年生存率只有20%～25%，局部复发风险高达50%[1]。可见早期诊断的重要性。食管癌在中国恶性肿瘤死亡中占第4位[2]，每年全世界新诊断的30万食管癌患者中有一半发生在中国[3]。尽管有吞钡检查、胃镜、超声内镜、支气管内超声、CT、PET/CT等检查方法，可是早期食管癌诊断的问题仍未圆满解决。中西医结合影像学是一门新的边缘学科，中医中药在影像检查中的应用是中西医结合影像学的一个重要部分，也适合基层医院开展。食管蠕动速度很快，对比剂难以长时间停留，这一直是食管影像检查的难点。白芨可以增加对比剂的粘滞性，延长对比剂在食管中的停留时间，为MRI检查争取时间，我们于2006～2013年对此进行了初步探索，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 主要实验材料
碘油，淮海制药厂出品，浓度40%；白芨粉及蒸馏水，本院制剂，2011.11.30；碘，湖州化学试剂厂，批号：990702，99.8%分析纯，氯0.003%，不挥发物0.005%；碘海醇，奈克明爱尔兰有限公司，GB7653-87，浓度：300 mg/mL；泛影葡胺，中国信宜药厂；大豆油，上海嘉里粮油工业有限公司，GB7653-87；菜子油，杭州瓜沥镇生产；一次性注射器，杭州龙德医用器械有限公司，GB15811-1995。猪小肠，猪食管，猪肝，鱼泡。
1.2 主要扫描设备
磁共振成像仪：美国GE公司Vectra Ⅱ0.5T超导型，0.35T永磁型；西门子公司0.2T、1.0T和1.5T超导型。
1.3 样品制备
制备碘油样品，取40%碘油10 mL，吸入一次性塑料注射器内，去掉针头，针芯折断排除气体，封口备用。取12 mL蒸馏水作为对照。取10 mL大豆色拉油，10 mL泛影葡胺，10 mL菜子油，10 mL碘海醇及50 g碘（分析纯），装瓶。将试管顺序排列于塑料试管架，放于1.5T、1.0T、0.5T、0.2TMR的线圈中心进行扫描。1.5T设备DWI成像参数：b1=0 s/mm2，b2=（600～1000） s/mm2，TR/TE=（3000～5000）/min，NEX=8，层厚=5 mm，层间距=1 mm，FOV=360～420 mm，矩阵=128×128，扩散方向=3。SS-FSE成像参数：冠+轴，屏气，TR（ms）=∞，TE（ms）=60～90，层厚=5 mm，层间距=1 mm，FOV=360～420 mm。
1.3.1 每层图像以圆形ROI（0.20-0.30） cm2测定信号强度值，取3层信号强度的平均值，为S值进行对比。作试管标本MR信号强度扫描参数曲线。采用t检验。
1.3.2 取40%碘油10 mL加白芨粉0.4～1.8 g，搅拌均匀，吸入一次性塑料注射器内，注入猪食管腔内用GE0.35T的MR仪进行多参数扫描。
2 结果
①每100 mL碘化油加入9 g精制白芨粉，作为食管对比剂有黏性好的特点，还有止血作用，并且药品来源丰富，价格低廉。②碘化油在T1WI像上呈稍高、等信号，T2WI像上无信号与本底噪声没有差别，见图1。碘油的信号强度低于油脂的信号强度，见图2。碘在MRI各个序列上均不成像，并且影响其他物质。③碘油在体外DWI序列上呈低信号，STIR上较低信号。其信号强度SNR=05.23 sd04.12和55.55 sd06.15。与正常食管信号对比中均为低信号。
3讨论
1965年Stejskal EO和Tanner JE首先阐述了DWI序列[4]。弥散加权成像（diffusion-weighted imaging）实际是测量水分子的微观运动。弥散即布朗运动，由分子动能产生，具有温度依赖性，是分子的随机热运动。DWI（b0，b500，b1000）可以使临床可疑的多发性直肠癌特异性和内在的观察性增加[5]。DWI成像上胃癌呈中高信号，敏感度高，定性准确，ADC值还具有定量分析价值[6]。随着福岛核事故的蔓延，在世界上造成了巨大的社会影响[7]，辐射已成为人们广泛关注和议论的话题。CT是高辐射剂量的检查手段，随着CT应用的增多，群体辐射剂量也明显增加。诊断X线所产生的世界人口年均有效剂量占人工辐射源总年均有效剂量的95%以上， 2000年ICRP统计显示，世界范围内的CT检查占放射学检查的5%，但辐射剂量占整个放射学检查的34%，在美国甚至高达67%，CT所引起的电离辐射风险已成为严重的医疗问题和社会问题。褚群报道，0.05Gy的辐射即可检测到辐射损伤，剂量累积到0.15Gy时辐射损伤显著增大。头部常规剂量扫描实测表面剂量为80.00mGy（0.08Gy），可见辐射的危害性之大。医疗是人工辐射最主要的来源[8]，且吞钡、CT、PET/CT等带有辐射损伤的检查方法对早期食管癌诊断的问题仍未圆满解决[9]。CT对食管癌早期诊断的特异性、准确性均不高，仅对术前分期有一些作用。超声内镜和支气管内超声主要用于穿刺活检。食道拉网只在食管癌高发区集体普查有效，对于散发病例无法常规使用。早期食管癌症状多不明显，易被忽视。传统吞钡检查受个人技术影响程度大，受检者比例在不断下降。PET/CT有3.7%的假阳性率和5%的漏诊率。超声虽然没有辐射，但是，对于空腔脏器难有作为，超声内镜鉴别T2期与T3期存在困难。应用水分子成像诊断早期食道癌的研究具有重要的临床意义。对于水成像磁共振具备其他设备所没有的优势[10]。对于碘油成像磁共振也有特点[11]。
复合材料可以发挥不同材料的优势，弥补单一材料的不足，通过不同性能材料的加入，使二者相互补强，进而提高对比剂的流体力学强度、黏附性等问题[12]。因此用白芨精制颗粒加入到碘油中，是强化对比的首选材料。
与CT比较MRI对软组织的改变更加敏感，食管黏膜下病变、黏膜病变、器官形态结构改变的病变、管腔外病变影响、功能改变为主的病变和临近脏器病变的影响和侵及等病变都能显示。弥补了传统方法的不足，可提高诊断效率，为治疗方案的制定提供切实的依据。临床医生能否选用最有效的疾病检查方法也是衡量医生能力的指标之一[13]。
白芨亦名白及、甘根（《本经》）、冰球子（《贵州民间方药集》）等。味苦、甘， 性凉。入肺、胃、肝经。内服：煎汤，3～9 g；或入丸、散。外用；研末撒或调涂。主要成分：新鲜块茎含水分14.6%、淀粉30.48%、葡萄糖1.5%。尚含挥发油、黏液质。根含白芨甘露聚糖（Bletilla mannan）。白芨块茎含有的多量黏液质是一种抗癌成分，推测白芨对致癌物质二甲基氨基偶氮苯的毒性可能有一定的对抗作用。白芨多糖是一种高分子黏性化合物，由葡萄糖与甘露糖以1：4的比例聚合而成， 以β糖苷键连接。程安媛的研究表明，芨多糖是一种典型的假塑性流体，其粘度随着剪切速率的增加、温度的增高而降低；可黏附于体内黏膜、组织相容性好， 在黏膜表面可形成一层保护膜。对正常组织和模型组织，白芨多糖的留存量分别达60%左右，黏附性与浓度正相关。新鲜白芨削去表皮， 用灭菌生理盐水洗净， 按1：10的比例加入无菌蒸馏水， 冷浸1夜， 至次日加热至沸， 已经灭菌处理的4号玻璃漏斗减压过滤。滤液分装玻璃瓶内， 熔封。15磅高压蒸气灭菌30 min， 即成为白芨胶浆。我们采用精制粉末避免水油分层的问题。
碘化油（Oleum Lodisatum）为植物油与碘结合的有机碘化合物，以大豆油或核桃油为原料。油类中不饱和脂肪酸多，其烃基的不饱和双键使油呈液态，有色有味。液态油通过加成反应而变成固态的脂肪，颜色和臭味也就随同消失。脂肪酸中的双键与碘的加成作用吸收碘。
碘油在扩散加权成像和脂肪抑制序列图像上为低信号，其信号强度SNR=05.23 sd04.12和55.55 sd06.15。3‰和10‰釓对比剂在STIR序列的图像上信号强度SNR=65.52 sd07.16和844.64 sd15.58。3‰和10‰釓对比剂在扩散加权成像序列的图像上信号强度SNR=06.13 sd05.11和270.95 sd49.41。信号噪声比与图像对比度密切相关[14]，不考虑噪声是不能评价对比度的。DWI测量的食管病变长度与手术切除病理大体标本无显著性差异[15]。可以用DWI和STRI来区分碘油，判断碘油的沉积情况，同时显示肿瘤的信号。
临床实验前还需要做更多的工作。首先应用小白鼠每天灌胃2次，进行半数致死量毒理试验；然后用HITACHI S-570扫描电子显微镜（SEM）观察复合材料表面及其断口截面的形貌（试样喷金处理后观察）。还要采用FASCO全自动流变血液快测仪，高中低三种剪切速率测定白芨碘油的黏度。
分组 实验动物分为6组：①组：100%白芨；②组：70%白芨；③组：50%白芨组；④组：10%白芨组；⑤0无白芨组。⑥肿瘤造模加10%白芨组。白芨多糖膜黏附性体内评价以碘油试剂造影建立白芨体内黏附性评价方法，考察白芨在不同浓度组大鼠的食管内滞留情况。各组每天灌胃1次。
手术 灌胃5 min后，动物备皮、排便后，置于手术台上固定。术前预防性应用青霉素320万U，静滴。采用2%硫喷妥钠静脉麻醉，剂量为（25～40）g/kg， 常规碘尔康消毒术野皮肤后，铺无菌中单，切开皮肤、皮下、结扎止血。切开食管，观察碘油黏附情况。术中出血以明胶海绵填塞止血。以上各组术后24 h开始排便或听到肠鸣音后，开始进食，自由活动，术后前3 d静滴青霉素，伤口清洗换药。术后不能自行排便排尿者，酌情予灌肠或临时导尿。
术后处理 术后予青霉素160万U/支静滴3 d，每日1次，以预防感染，术后两周切口愈合后拆线。允许其自由活动，术后10 d内每日查体，以后每周1次。
取材 各组分别随机选取1只动物在麻醉下用空气栓塞法分别随机处死 ，作组织形态学观察。切取碘油黏附点及周围组织块。标本的制作：4%多聚甲醛固定24 h，采用常规制作石蜡切片，分别用来进行HE染色和TUNEL染色。切片荧光显微镜下观察。
光镜组织学观察 主要观察碘油与黏膜间药膜形成情况以及计算界面碘油结合率。随机选取部分标本，在黏膜界面随机选取4个视野，测量视野内界面碘油结合的长度和界面总长度，碘油结合率=视野中界面结合长度÷视野中界面总长度×100%
大鼠脑细胞形态变化 ①灌注固定，断头用止血钳夹住动脉断端，用针头刺入动脉，先快速推注含肝素（20 U/mL）生理盐水50 mL冲洗，然后灌注4%多聚甲醛50～ 80 mL，时间10 min。开颅取出脑组织，分别取大脑、小脑、海马，4%多聚甲醛固定24h后置于20%～30%的蔗糖溶液中，4℃过夜。②异戊烷-液氮速冻法，取50 mL异戊烷倒入烧杯，将异戊烷烧杯置于液氮内，预冷至无气雾时，将脑组织迅速浸入，10～20 s后取出，复温至-20℃后OCT胶包埋切片。③在暗室中，将大鼠海马组织冰冻切片放入恒温26℃的50%阿拉伯胶、枸橼酸缓冲液、5.6%对苯二酚和17%硝酸银混合溶液中，染色20～30 min。经蒸馏水冲洗15 min，乙醇及二甲苯脱水透明，明胶封片，光镜下观察大鼠脑细胞形态变化。
大鼠肝细胞凋亡检测 每组抽取2只动物进行MRI扫描，然后处死并立即取其肝脏，一半肝脏立即用4%多聚甲醛固定24 h，采用常规制作石蜡切片，分别用来进行HE染色和TUNEL染色。①大鼠肝细胞凋亡检测显微镜计数：TUNEL染色观察大鼠肝细胞凋亡情况。石蜡切片脱腊，水化处理。滴加100 μL蛋白酶K溶液（20 mg/L，10 mmol/L Tris/HCl，pH7.4～8.0），37℃下孵育15～30 min。用PBS洗2次，每次5 min，自然晾干。加50 μL TUNEL反应混合液在样品上，阴性对照用50 μL标记缓冲液代替TUNEL反应混合液，切片放入湿盒中，37℃下暗室孵育60 min。PBS洗3次，每次5 min，晾干。加50 μL converter-POD，湿盒中37℃下暗室孵育30 min。PBS洗3次，每次5 min，晾干。加50～100 μL DAB显色剂，DAB为浓缩试剂盒，按1：20倍稀释，显微镜下控制显色结果。PBS洗3次，每次5 min，晾干。用苏木素复染，立即用水冲洗。无水乙醇-95%乙醇-90%乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。②切片用光学显微镜进行观察并拍照保存。对每个组选取15个视野，对视野中的凋亡细胞进行计数。肝细胞凋亡结果以凋亡细胞数与视野中总细胞数的比值表示。③大鼠肝细胞形态学检测：按照常规方法进行HE染色，观察大鼠肝细胞形态变化。
脑过氧化氢酶（catalase，CAT）活性、丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性、乙酰胆碱酯酶（AChE）活性、一氧化氮合酶（NOS）活性测定：用南京建成试剂盒测定。断头取脑，电子天平准确称重后加入预冷生理盐水，制成10%的脑组织匀浆，分两管离心，第1管离心后的上清作为脑CAT活性、SOD活性、AChE活性、脑MDA含量检测的样本。第2管离心后的上清作为NOS检测的样本，检测方法按试剂盒说明书进行，对结果进行统计分析。
在我们的前期研究中，发现碘油可以起到良好的对比作用，是一种无细胞毒性、无急性体内毒性、并具有良好组织相容性的对比剂材料。已能通过MRI进行一系列体内外实验在早期食管癌诊断中使用水分子成像。通过实验证实，碘油白芨复合材料能提高界面处的结合率，增加界面处的黏附强度，是一种理想的MRI对比剂材料。因此，对水分子成像DWI诊断早期食管癌的研究工作继续深入下去，制备成碘油白芨MRI对比剂，进行进一步的实验研究，为患者提供安全、实用、有效、价格较低的检查方法。为进一步改进早期食管癌的研究提供重要的理论依据和数据支持，提高早期食管癌的诊断水平，早发现、早治疗，提高患者生存率和生活质量，为临床诊断治疗中的应用提供参考依据，从而形成新的检查方法，产生较大的经济效益与社会效应。
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（收稿日期：2013-02-04）