从钙超载角度探讨通脉养心丸心肌保护作用的机制

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摘要：目的从抑制钙超载的角度探讨通脉养心丸抗细胞凋亡保护心肌的作用机制。方法采用大鼠心肌细胞原代培养方法获得正常心肌细胞并建立缺氧损伤细胞模型，采用FLIPR Calcium 4 试剂盒检测药物对胞浆内钙离子浓度变化的影响；Annexin V/PI双染法检测心肌细胞总凋亡率。结果缺氧损伤组心肌细胞胞浆内钙离子浓度显著升高（P

关键词：通脉养心丸 心肌细胞 钙超载 细胞凋亡

中图分类号：R542.2R289.5文献标识码：A文章编号：1672-1349(2011)05-0562-02

Investigation of Protection Mechanism of Tongmai Yangxin Pill on Myocardium from the Perspective of Calcium Overload

Xiao Yang，Zhang Jiafu，Zhang Ling，et al

Tianjin University of Traditional Chinese Medicine (Tianjin 300193)

Abstract:ObjectiveTo observe the effect of Tongmai Yangxin pill (TYP) on apoptosis and ［Ca2+］i in cultured hypoxia cardiomyocytes，and explore the mechanism of myocardial protection.MethodsPrimarily cultured neonate rat cardiomyocytes were used to establish the hypoxia models.［Ca2+］i of cardiomyocytes loaded by Fluo-4 was analyzed by Multiskan Ascent immediately.The apoptosis percentage of cardiomyocytes was measured by Annexin V/PI flow cytometry.ResultsCalcium in hypoxia cardiac myocytes injury group was significantly higher. Calcium in TYP group were significantly lower than that in hypoxic injury group(P

Key words：Tongmai Yangxin pill；Cardiomyocytes；Calcium overload；apoptosis

通脉养心丸是由传统组方生脉散与炙甘草汤加减而成，具有养心补血、通脉止痛的功效。临床主要用于胸痹心痛、心悸怔忡等证的治疗。长期临床实践表明，通脉养心丸可有效缓解胸痛、胸闷憋气、心悸气短等症状，减少心绞痛发作频数。但对其药理作用机制的研究尚不完善。本研究采用大鼠心肌细胞原代培养方法获得实验用正常心肌细胞，并建立缺氧损伤细胞模型，从抑制心肌细胞钙超载的角度探讨通脉养心丸抗细胞凋亡，保护心肌的作用机制，为临床应用提供科学依据。

1材料与方法

1.1实验动物Wistar大鼠，50只，体重300 g±20 g，雄性，购于中国医学科学院协和动物研究所。Wistar大鼠，20只，1 d~3 d龄，雌雄不拘，购于中国医学科学院放射研究所。

1.2药品与试剂通脉养心丸（天津中新药业集团股份有限公司乐仁堂制药厂提供，每10丸重1 g,C107074）；DMEM/F12培养基(Hyclone，NUH0180)；胰蛋白酶（1:250，sigma）；Ⅱ型胶原酶（Gibco，461699）；5，-溴脱氧尿苷（brdu,sigma）;FLIPR Calcium 4 Assay Kit(Molecular Devices,122625)；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒（BD，批号：18354）。其他试剂为国产分析纯。

1.3主要仪器37 ℃ 5%CO2培养箱（THERMO，FORMA3111型，美国）；37 ℃ 94%N2-5%CO2-1% O2培养箱（THERMO，FORMA3131型，美国）；倒置相差显微镜(LEICA DMIL，德国)；台式高速低温离心机(Biofuge primo R，美国)；多功能读板机（Multiskan Ascent，THERMO LABSYSTEMS，美国）；流式细胞仪（FACS，美国）。

1.4含药血清的制备将50只Wistar 大鼠随机分为空白对照组及通脉养心丸1 g/kg、2 g/kg、4 g/kg、8 g/kg（日给药量）剂量组，连续给药3 d，于末次给药1 h后腹主动脉取血，56 ℃水浴孵育30 min灭活补体，3 000 r/min离心15 min后取血清，无菌条件下过滤分装入冻存管中，-20 ℃保存备用。

1.5心肌细胞原代培养及缺氧损伤模型制备心肌细胞原代培养参照文献方法［1］加以改良。取1 d~3 d龄 Wistar大鼠经75%酒精消毒30 s，将心室肌剪成（1～2） mm3的组织块培养。收集未贴壁的细胞悬液并调整细胞浓度至5×105/mL，接种于培养板中，于5%CO2培养箱中培养48 h后换液。前3 d用0.1 mmol/L 5，-溴脱氧尿苷（Brdu）以抑制非心肌细胞生长。

分组及缺氧损伤模型，取稳定生长的单层心肌细胞，用无血清DMEM/F12培养液培养48 h，使细胞生长同步化，并将细胞分为6组：正常对照组、缺氧损伤组及通脉养心丸1 g/kg、2 g/kg、4 g/kg、8 g/kg剂量组。采用MODEL3131型三气培养箱，94%N2、5%CO2、1%O2条件下缺氧孵育24 h，正常对照组于原条件下培养。

1.6检测指标 MTT比色法测定心肌细胞活力，并应用分析软件对心肌细胞浆钙离子浓度百分率与心肌细胞凋亡率进行相关性考察与回归分析，论证二者是否具有某种相关性。心肌细胞胞浆内钙离子浓度，数据用每孔细胞再次加药后荧光值占空白组荧光值的百分率表示。计算凋亡细胞百分率。

1.7统计学处理数据以均数±标准差(x±s)表示，采用SPSS 11.0软件进行分析，组间比较采用单因素方差分析。

2结果

2.1通脉养心丸对心肌细胞活力的影响心肌细胞在缺氧条件下孵育后，其活力下降，与正常对照组比较有统计学意义（P

2.2对缺氧损伤心肌细胞胞浆中钙离子浓度变化的影响缺氧孵育24 h后缺氧损伤组胞浆中钙离子浓度与正常对照组比较有统计学意义（P＜0.01）。再次加药后，约在40 s后各组细胞胞浆内钙离子浓度达到峰值，各给药组峰值与缺氧损伤组比较差异有统计学意义（P＜0.01），其中8 g/kg组效果最为明显。再次加药80 s~300 s各组钙离子浓度逐渐趋于稳定，此时各给药组钙离子浓度仍显著低于缺氧损伤组（P＜0.01）。详见图1。

与空白对照组比较，1） P

图1通脉养心丸对缺氧心肌细胞钙离子荧光强度的影响

2.3对缺氧损伤心肌细胞凋亡率的影响心肌细胞经缺氧损伤后，与空白对照组相比细胞凋亡率明显升高（P

2.4胞浆钙离子浓度与凋亡率的相关性各剂量组钙离子浓度荧光百分率与细胞凋亡率相关系数为0.945，成明显正相关。经回归分析95%可信区间（P

3讨论

通脉养心丸全方由生脉散与炙甘草汤加减而成，具有养心补血，通脉止痛的功效。方中地黄、鸡血藤、何首乌以及麦冬均具有钙离子拮抗作用，可不同程度抑制钙超载［2,3］ 。

细胞凋亡信号的异常表达使心肌细胞数量不可逆地减少，加重了心肌缺血损伤［4］。其发生凋亡的机制可能与长时间缺氧产生细胞内钙超载有关［5］。钙离子作为多种死亡信号转导的第二信使与细胞线粒体凋亡有着错综复杂的关系［6］，心肌缺血发生时，大量钙离子内流，同时钙离子的排出受到抑制，导致心肌细胞钙超载。此时，线粒体可释放CytC，CytC与脱氧腺苷三磷酸相互作用，并与Apaf-1结合，激活白细胞介素-1,3转化酶-9(Caspase-9)，被激活的Caspase-9又激活Caspase-3，促使细胞发生凋亡 ［7］。

本实验结果显示，缺氧条件可使心肌细胞胞浆内钙离子浓度显著升高，通脉养心丸4 g/kg、8 g/kg剂量组可以明显抑制心肌细胞内钙离子浓度升高，一定程度上减轻了心肌细胞钙超载。此外，通脉养心丸4 g/kg、8 g/kg剂量组可明显降低缺氧损伤引起的大鼠心肌细胞凋亡的发生率，对缺氧损伤的心肌细胞具有明显的保护作用。

本研究从心肌细胞胞浆内钙离子浓度变化为切入点，结合心肌细胞凋亡率对通脉养心丸心肌保护机制进行了初步探讨，二者的相关性说明该药能够通过抑制心肌细胞钙超载而降低心肌细胞凋亡的发生，进而发挥心肌保护作用。同时提示了该药剂量与疗效间也具有一定的依赖关系。通脉养心丸能否通过其他途径发挥心肌保护作用仍有待于进一步的研究。

参考文献：

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［2］陈丁丁，戴德哉，章涛，等.地黄煎剂抑制异丙肾上腺素诱发的缺血大鼠脑Ca2+ -Mg2+ -ATP酶活力升高［Ｊ］.中药药理与临床，1997，13(4):27-28.

［3］江涛，唐春萍，李娟妤，等.鸡血藤对大鼠主动脉收缩反应的影响［J］.广东药学院学报，1996，12(1)：33-35.

［4］陈万生，刘文庸，杨根金，等.首乌中1个新的四羟基二苯乙烯苷的结构鉴定及其心血管活性研究［Ｊ］.中国药学学报,2000，35(12):906-908.

［5］Tao J，Wang H，Zhou H，et al.The saponin monomer of dwarf lilyturf tuber，DT-13，reduces L-type calcium currents during hypoxia inrat ventricular myocytes［Ｊ］.Life Sci,2005，77(24):3021-3022.

［6］Zhao ZQ，Nakamura M，Wang NP,et al.Reperfusion induces myocardial apoptotic cell death［Ｊ］.Cardiovasc Res,2000，45(3):651-660.

［7］王保和.心肌缺血再灌注损伤机制研究及中药治疗进展［Ｊ］.天津中医学院学报，2004，23(2):104-106.

作者简介：肖扬（1985―），女，硕士研究生，现工作于天津中医药大学（邮编：300193）；张家福，工作于天津中新药业医药公司；张玲、邢永发、王怡（通讯作者），工作于天津中医药大学（邮编：300193）。

(收稿日期：2011-02-02)