拟南芥Rad23原核重组蛋白构建和活性检测

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摘 要：在拟南芥中，rad23基因通过参与泛素/26S蛋白酶体途径调节植物生长发育和激素应答.为进一步研究该基因编码蛋白的分子作用机制及其生物学功能，构建了pCold-Rad23融合蛋白重组表达载体，将该载体转化到大肠杆菌BL21中诱导表达目的蛋白.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果表明，分子质量为94 ku左右的融合重组蛋白在大肠杆菌中获得高效表达.采用纯化的重组蛋白多次免疫昆明小白鼠的方法，获得了特异性强并且效价高的多克隆抗体，经蛋白印迹检测，在分子质量40 ku左右处出现特异的蛋白质条带，证明所制备的抗血清可以与拟南芥Rad23蛋白特异性结合.

关键词：蛋白；泛素/26S蛋白酶体；原核表达；抗体

中图分类号：Q511 文献标识码：A

Purification of Arabidopsis Rad23 Recombinant

Protein in Engineering Bacteria

and Preparation of Its Polyclonal Antibody

LI Xiu-shan, LIU Bin, ZHAO Li-jian, TANG Dong-ying,

ZHAO Xiao-ying, LIU Xuan-ming

(College of Biological Sciences, Hunan Univ, Changsha, Hunan 410082，China)

Abstract:Rad23 gene which participates in ubiquitin/26S proteasome pathway in Arabidopsis， is known to play important roles in plant development and responses to hormone. In order to study its function and molecular mechanism, an expression vector pCold-Rad23 was constructed and transformed into E. coli BL21. Then the recombinant fusion protein was induced by IPTG.The results of SDS-PAGE have shown that Rad23 fusion protein existed in a soluble form with a relative molecular mass 94 ku, which is fit for the molecular mass supposed from gene coding frame. Finally, the Rad23 recombinant fusion protein was used as an antigen to prepare polyclonal antiserum in mice. The western blot results have shown that the polyclonal antiserum has high specificity and can react to the native protein expressed in different tissues of Arabidopsis.

Key words:protein; ubiquitin (Ub)/26S proteasome; prokaryotic expression; antibodies

蛋白泛素化是真核细胞内广泛存在的一种蛋白翻译后修饰方式，其在基因表达调控、细胞周期调控、DNA损伤修复及细胞凋亡等多种生物途径中发挥重要作用 ［1-2］.研究表明，作为一种复杂且高度调控的过程，蛋白质泛素化需要3类酶参与催化，这3类酶分别称为E1―泛素激活酶，E2―泛素耦联酶，E3―泛素连接酶.泛素化的整个过程大致如下：在ATP的参与下，E1的半胱氨酸活性位点与泛素C末端的甘氨酸首先形成硫酯键；接着，连接在E1上的泛素被转移到E2的活化半胱氨酸位点；最后在E3的催化下，泛素C末端与底物某个位点的赖氨酸氨基结合并被蛋白酶体识别和降解［3-6］.

目前已在拟南芥中发现有上千种基因表达产物具有泛素连接酶E3的功能［7-9］，它们主要通过介导泛素/26S蛋白酶体途径，参与26S蛋白酶体调控细胞内大多数蛋白质的降解［10-11］.如Rad23(radiation sensitivity protein-23)就是其中的一种，该蛋白N端具有一个能够和蛋白酶体结合的UBL(ubiquitin-like)区域，C端含有二个可和ubiquitin结合的UBA(ubiquitin-associated) 区域，其中起主要调控作用的是位于C端中心区域UBA1，去掉靠近C端末尾的UBA2区域并不影响ubiquitin结合功能［12-13］.这些特定结构域的存在，使得Rad23蛋白能通过选择性的与其他蛋白特定位点的结合，精确地调控蛋白泛素化，为泛素蛋白酶体精确调控相关蛋白降解奠定了基础.

1 材料和方法

1.1 材 料

主要试剂：限制性核酸内切酶Xho I，EcoR I，Taq DNA 聚合酶和T4 DNA 连接酶为MBI公司产品.ELISA试剂盒、HRP 标记的羊抗鼠IgG均购自杰辉生物技术有限公司.RPMI1640和胎牛血清购于Invitrogen公司，弗氏佐剂购于Sigma公司.载体与菌株：菌株E.coli DH5α,E.coli BL21(DE3) 和Sp2/0细胞由本实验室保存，质粒pCold-TF购买于TaKaRa公司.实验动物：昆明小白鼠购自中南大学动物实验中心.

1.2 方 法

1.2.1 重组质粒构建与鉴定

公司pCold-Rad23重组表达质粒的构建与鉴定，以AT5G38470基因为模板，上游引物5′-CCGCTCGAGATGAAGATTTTCGTGAAGACT CTCA-3′(引入Xho I酶切位点) ，下游引物为5′-CCGGAATTCTTATTGATCTTCAAACTCATGC-3′(引入EcoR I酶切位点) .PCR 扩增条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s， 60 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，30 个循环；72 ℃后延伸10 min.用Xho I和EcoR I分别双酶切PCR 产物和pCold 原核表达载体，回收的酶切产物用T4连接酶连接后转入大肠杆菌DH5a中培养，挑取单克隆进行酶切及测序鉴定.

1.2.2 重组蛋白在大肠杆菌中的诱导表达

将构建的重组质粒pCold-Rad23 转化到宿主菌BL21中，取1 mL经不同摩尔浓度IPTG诱导处理的细菌离心，去上清后加入SDS凝胶上样缓冲液100 ℃煮沸5 min，12 000 r/min室温离心5 min，取20 μL 进行SDS-PAGE 电泳检测蛋白表达.

1.2.3 镍柱亲和层析分离纯化重组表达蛋白

将1 L经0.6 mmol/L IPTG诱导处理的pCold-Rad23阳性菌(BL21)收集离心，去上清后将沉淀重悬于Lysis buffer中4 ℃超声波粉碎，12 000 r/min 离心，取上清和Ni2NTA agarose 混合，4 ℃条件下搅拌1 h，经咪唑浓度梯度法分离纯化蛋白(咪唑摩尔浓度分别为10，50，100，150，250 mmol/L )，纯化蛋白用透析法去除咪唑，透析后的蛋白分装冻存于-80 ℃.

1.2.4 拟南芥白提取

分别取野生型拟南芥的根、茎、叶、花组织2 g，加入4 mL提取缓冲液，匀浆破碎细胞，经三层滤膜过滤后弃去沉渣，将上清液350 g，4 ℃，8 min离心，弃去上清，沉淀用含l%TritonX-100的提取缓冲液重悬；350 g，4 ℃离心8 min，弃去上清，沉淀再用提取缓冲液重悬；350 g，4 ℃离心8 min，收集沉淀并加入100 μL上样缓冲液(2×)，混匀，金属浴加热10 min, -20 ℃保存.

1.2.5 蛋白质印迹检测

以纯化前后的pCold-Rad23蛋白样品和拟南芥不同组织提取的蛋白经SDS-PAGE电泳，然后将PVDF膜放甲醇溶液中浸泡5 min后，将膜和6张滤纸均用DTB缓冲液浸泡5 min，然后放置在半干转移仪上进行转移.转移1 h后，将膜用5%牛奶液封闭1 h.用PBST洗膜3次后，以鼠血清(将鼠血清按1∶3 000稀释)为一抗温育1 h；洗膜后以HRP标记的羊抗鼠多抗(1∶3 000稀释)为二抗温育1 h；PBST液洗膜3次后，加入显色液A和B显色1 min，然后显影.

2 结 果

2.1 pCold-Rad23重组表达质粒的构建与鉴定

琼脂糖凝胶电泳检测以Rad23(AT5G38470)基因为模板进行PCR扩增的产物，可见大小为1 100 bp左右的特异性片段(图1（a）).将双酶切的PCR产物和pCold-TF大片段连接过夜后转化E. coli TOP10感受态细胞，提取经菌落PCR鉴定为阳性的克隆质粒DNA，XhoⅠ和EcorⅠ双酶切结果表明：阳性质粒可切出约1 137 bp的目的片段(图1（b）)，将该片段进行测序后与NCBI提供的序列相比对，发现测序结果与检索序列完全一致.

2.2 pCold-Rad23蛋白诱导表达

将鉴定正确菌株，接种到LB培养基中，摇菌2 h后，加入不同浓度的IPTG，比较IPTG诱导浓度对融合蛋白表达影响的结果发现：诱导24 h后，即在约94 ku处有目的蛋白条带的出现，重组蛋白对IPTG浓度变化(从0.2 mmol/L到1.0 mmol/L)不敏感(图2)，但未加入IPTG条件下，重组目的蛋白

基本没有诱导表达.随后，通过对构建的重组蛋白分别在不同温度、不同时间和不同OD值条件下诱导，结果发现：在不同诱导温度下，低温(0~13 ℃)和较高温度(18~30 ℃)下蛋白表达较少，蛋白表达最适合温度为15 ℃.重组蛋白表达量受诱导时间(从2 h到30 h)和诱导菌液OD值(从OD0.2到OD1.4)影响较大(数据另文发表).

2.3 pCold-Rad23蛋白纯化

诱导24 h的菌体蛋白经6×His标签亲和层析吸附后，利用不同浓度咪唑(从10 mmol/L到100 mmol/L)梯度洗脱，将收集液体经12％SDS-PAGE分离，结果显示：在10 mmol/L咪唑下目的蛋白和杂蛋白都被洗脱下来，而在50 mmol/L咪唑浓度条件下，很少有目的蛋白被洗脱下来，说明在10 mmol/L咪唑浓度下蛋白还有未完全结合的目的蛋白，而在100 mmol/L咪唑浓度梯度下的目的蛋白被大量洗脱下来(图3)，而且杂蛋白很少，利用咪唑浓度梯度法，得到了较纯的94 ku目的条带 (图3)，所制得的重组抗原可以用于免疫动物制备抗血清.

2.4 Western-blotting 鉴定

为了检测制备血清的特异性，我们利用Western-blotting考察了该血清对纯化前后重组蛋白的识别效果.从实验结果(图4)可以看出：多克隆血清与重组蛋白杂交后可在胶片上产生特异性条带，分子质量为94 ku左右，条带大小与预期重组蛋白太小完全相符.此外，我们进一步考察了多克隆血清识别拟南芥细胞Rad23蛋白的可能性，从实验结果(图4)发现：拟南芥的不同组织样品蛋白均能与制备的抗体特异性作用，在分子质量为40 ku的位置均能产生特异性条带，与推测拟南芥Rad23蛋白的分子质量一致，在检测的样品中，该基因在花中表达最多，茎中较少，这些结果证明制备的抗体具有高特异性.

3 讨 论

本研究利用分子克隆了Rad23基因，并采用原核高效表达载体表达了pCold-Rad23蛋白.该载体系TaKaRa公司最近推出的一种新的高效表达载体，它含有一个cspA(cold shock pretein A)启动子能够促进重组蛋白在低温下大量表达，同时在低温条件下亦可抑制其他杂蛋白表达，有趣的是该载体还含有一个TF结构的伴侣蛋白，该结构能促进融合目的蛋白的正确折叠，有利于重组蛋白在上清中表达.与现阶段一些原核表达载体相比，该载体特有的结构不仅能促进目的蛋白在上清高效表达，还可降低其他杂蛋白的产生，为下一步纯化提供了便捷.

在酵母中已开展了许多关于Rad23蛋白家族功能研究工作，但在植物体内其具体作用机制还不是很清楚，为进一步研究植物体内Rad23蛋白的具体功能和相关作用机制，本实验室构建了pCold-Rad23基因重组蛋白，并制备了具有高效特异的抗体，该抗体不但能识别重组蛋白，还特异性识别植物体内的天然蛋白，WB鉴定发现该天然蛋白主要在拟南芥花和叶中表达较多，而在植物的茎中表达较少，这可能与该基因家族具有抗紫外修复功能有关.最近研究报道发现Rad23基因家族参与了泛素/26S蛋白酶体途径［11］，参与相关蛋白的调控，但其具体作用机制还不是研究得很清楚，还需进一步对Rad23蛋白在植物体内作用机制开展研究.

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