萝卜花药愈伤组织诱导与分化影响因素的研究

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摘 要：以5个萝卜品系为材料探讨了不同培养方式、激素与基因型对花药愈伤组织诱导的影响．结果表明固液双层培养较固体与液体培养效果好，0.2mg/L 2，4-D与4.0mg/L KT+0.2mg/L NAA对花药愈伤诱导率较高，4.0mg/L KT+0.2mg/L NAA的激素组合愈伤组织生长快，NAA为2.0mg/L时根分化明显，各种激素处理均未见芽的分化，5个品系中NAU-Yb-03与NAU-Dy－13－03对激素反应较为敏感；NAU-Dq-03在所有的处理中均未见愈伤组织的形成。

关键词：萝卜；花药；愈伤；培养方式；激素；基因型

中图分类号：S631.1

文献标识码：A

文章编号：1007-7847(2007)01-0090-05

萝卜(Raphnus sativus L.)为十字花科重要蔬菜作物，我国作为其起源地之一，有着丰富的种质资源，充分利用这些资源进行品种改良，获得优良的新品种对于提升我国萝卜生产水平有着重要作用，利用单倍体进行种质资源遗传研究与新品种的选育具有快速、稳定的优点，目前获得单倍体的主要方法有理化诱变、远缘杂交、大孢子培养、花药培养与小孢子培养等，其中花药培养是目前运用最为广泛的方法之一，并已在番茄、辣椒、大白菜等多种蔬菜作物中得到了应用，在萝卜上，Lichter等(1989)首先通过小孢子培养获得了萝卜单倍体植株，但这种培养方式由于受到基因型的限制，诱导率仍很低，梅时勇等(2002)首先报道对不同萝卜品种进行花药培养，获得了萝卜单倍体植株，但是对于其高频离体诱导培养体系仍存在许多限制因素，为此开展萝卜花药单倍体诱导体系研究有着重要的理论和实践意义。

如何改变小孢子发育途径，使小孢子脱分化形成无极性的愈伤组织或者胚状体，进而再分化或直接形成植株是花药单倍体高频再生体系建立的关键，其中通过愈伤组织形成植株是最常见的发育途径，离体条件下采用的培养方式、激素类型与浓度以及基因型的选择是影响花药愈伤组织形成与再分化的重要因素，为此本研究从这3个方面对影响萝卜花药愈伤组织脱分化与再分化的因素进行探讨，以期为萝卜单倍体高频诱导体系的建立提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

选用NAU－Dy-13-03,NAU-Yb-03,NAU-Lcxh-02、NAU-Cdms-04、NAU-Dq-03等5个高代自交系为材料，2005年春季种植于南京农业大学江浦园艺站。

选取健壮植株上处于单核靠边期的花蕾(约为2－4mm)，将花序轴插入水中，置于4℃冰箱中低温处理2d，接种前将花蕾用75％酒精浸泡30s，然后置于0.1％HgCl2中消毒7min，无菌水冲洗3次。

1.2 花药愈伤组织的诱导

以NAU－Dy－13－03为材料，采用固体、液体、固液双层3种培养方式，分析不同培养方式对花药愈伤组织诱导的影响；以固液双层方式分析不同激素组合对花药愈伤组织诱导的影响；以5个萝卜高代自交系为材料。设置I、V、X、XIV、XV、XVI5组激素组合(表1)，通过固液双层培养方式，分析不同基因型对花药愈伤组织诱导的影响，固体培养培养基采用MN(N6大量+MS微量+有机)+0.65％琼脂+6％蔗糖+不同激素配比，每个60×15mm培养皿20mL；液体培养采用MN+6％蔗糖+不同激素配比，每个100mL锥形瓶20mL；固液双层培养下层固体培养基采用MN+0.65％琼脂+6％蔗糖，上层液体培养基采用MN+6％蔗糖+不同激素配比，每个60×15mm培养皿固体培养基1.5mL，液体培养基2mL，各种激素配比如表1所示。

2 结果与分析

2.1 不同培养方式对花药愈伤诱导的影响花药接种在3种培养基上反应不同，在液体培养条件下，花药大小无明显变化，颜色由绿色渐渐转为浅褐色，培养30d未见愈伤组织形成，固体培养与固液双层培养在培养4d后，花药形态上开始发生变化，固体培养在激素配比VI、XIV、XV下花药颜色由绿色转为浅黄色，并向花药内侧弯曲，形成弓形，3个星期后可见黄色的愈伤组织形成，愈伤组织形成量极少，并且生长慢；处理X与XⅥ下花药黄化并逐渐转为褐色；其它激素配比无明显反应，在固液双层培养条件下，当在V与X激素配比时花药发生弯曲，但呈绿色，两个星期后即可见白色愈伤组织形成并有光泽，生长快，可见，花药在固液双层培养下能够保持较高的活性，并且形成的愈伤组织活力较高，可能是这种培养方式更有利于激素吸收利用。

2.2 不同激素类型与浓度对花药愈伤组织诱导 影响

2.2.1 不同浓度KT对花药愈伤组织诱导影响在固液双层培养条件下，不同浓度的KT对NAU－Dv－13－03萝卜愈伤组织诱导结果(表2)表明．添加较低浓度的细胞分裂素KT有助于愈伤组织的形成(处理Ⅱ)，但愈伤组织生长相对较慢．当KT达到2.0mg/L时(处理Ⅲ)，花药由绿逐渐转黄，愈伤组织诱导率明显降低。4.0mg/L时花药受到明显的抑制作用，花药转为深黄色，体积变小，未见愈伤组织形成，可见单独使用KT虽然有少量愈伤组织的形成，但是愈伤组织生长状态较差，高浓度对愈伤组织诱导表现负作用。

2.2.2 不同浓度2，4－D对花药愈伤组织诱导影响

在固液双层培养的液体培养基中添加适当的2，4－D(处理V、Ⅵ)，对NAU－Dy－13－03花药愈伤组织诱导作用明显，花药在培养的前3d膨大明显、生长快，呈浅绿色，表现较高的活性。当2，4－D浓度为0.2mg/L时，愈伤组织诱导率达20％，白色愈伤组织生长快，色泽鲜艳。但达2.0mg/L时愈伤组织诱导率降低到10％，而4.0mg/L时无愈伤组织形成，花药黄化体积变小，表明适当浓度的2，4-D对愈伤组织诱导有利，

2.2.3 KT与NAA组合对花药愈伤组织诱导影响

KT与NAA配合使用结果表明，当NAA为0.2mg/L，KT为2.0mg/L时有愈伤组织形成，但愈伤组织生长状态较差，呈黄色(表2)，KT增至4.0mg/L愈伤组织呈白色(图1a)，生长快，诱导率达11.7％，表明合适的KT与NAA比例可以诱导出质量较好的愈伤组织。均无愈伤组织形成．表明2，4－D浓度过高对NAU―Dy－13―03愈伤组织诱导不利，即使添加KT也不可以改变这种负作用，因此2，4－D与KT配合使用对于萝卜花药愈伤组织诱导增效不明显。

2.3 基因型对花药愈伤组织诱导的影响

由表3可知，5个不同基因型品系除NAU－Dy－13―03之外，其它4个品系在处理V与处

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理X中均有愈伤组织形成，并且处理V效果比处理X效果好，不同基因型对激素表现出相似反应，对于NAU-Yb-03在处理XIV、XV与XVI表现出了较高的愈伤组织诱导率，但是在处理XV与处理Ⅵ中愈伤组织生长较慢、无光泽、呈黄色，生长状态较差，因此不同基因型对激素反应存在一定差异。

2.4 激素对愈伤继代培养影响

在所有的继代处理中，发现添加2，4-D愈伤组织生长停滞，呈现黄化现象，并且逐渐失去活力，表明2，4-D对愈伤组织的进一步生长有抑制作用，当继代培养基中单独添加2.0mg/L KT，愈伤组织同样呈现黄色，不生长的现象；但当KT达4.0mg/L时，愈伤组织均转化为绿色(图1b)，达6.0mg/L时，愈伤组织转黄，逐渐失去活力，添加NAA对愈伤组织生长有重要影响，当KT为4.0mg/L时，添加0.2mg/L或1.0mg/L NAA愈伤组织7 d体积可增加约一倍，但当NAA达2.0mg/L时，愈伤组织生长速度减慢，根分化明显(图1c)，可见为使愈伤组织迅速增殖，KT与NAA配合施用是必要的。

3 讨论

通过合适的培养方式获得最佳的通气与营养吸收环境是花药培养获得成功的重要方面，Phippen(1989)在进行花椰菜愈伤组织培养时发现固体培养明显好于液体培养，研究认为通过固液双层培养方式进行花药愈伤组织诱导能够很好地解决营养与通气的矛盾，更利于花药愈伤组织的诱导，本研究为了准确探讨激素对花药愈伤组织的影响，在固液双层培养中固体培养基未添加激素，但在合适的激素配比下同样有愈伤组织的形成，且相对于固体培养能使花药保持较长时间的绿色，表明固液双层培养中液体培养基中的激素对于愈伤组织的诱导起关键作用，当花药愈伤组织长到2mm之前及时转移，液体培养基中的营养与激素足以愈伤组织生长所需，同时固体培养基富含的水分可以减缓液体培养基的挥发，使激素保持较高的活性状态。

研究认为激素在启动细胞脱分化过程中有重要作用，其中生长素和细胞分裂素是两类重要的调控激素，2，4-D作为一种重要的生长素对于愈伤组织诱导有较好效果，在某些作物上甚至是必需的，但是不同的作物所要求的浓度不同，HongChang等(1991)研究发现2.0mg/L的2，4-D与1.5mg/L的KT配合使用对玉米的花药愈伤组织诱导效果较好，Kiviharju等(1999)发现高浓度的2，4-D(5－6 mg/L)有利于燕麦胚胎的形成，本研究结果表明0.2mg/L的2，4-D对萝卜花药愈伤组织诱导频率较高，高浓度2，4-D对愈伤组织诱导不利，且与KT配合使用效果不理想，且没有2，4-D的情况下KT(4.0)+NAA(0.2)同样也有较高的花药愈伤组织形成，表明2，4-D对萝卜花药愈伤组织诱导有促进作用但不是必需的。

基因型对花药愈伤组织的形成有着重要的影响已在多种作物中得到了证实，本研究证实基因型效应在萝卜的花药愈伤组织形成过程中也同样存在，NAU-Dy-13-03品系对愈伤组织形成不敏感．在各种处理中始终未见芽的分化，2，4-D对愈伤组织的分化有一定的抑制作用，与Zhang等(2001)研究基本一致，NAA达2.0mg/L时有根的分化，祝仲纯等(1980)通过萝卜下胚轴进行植株再生时发现愈伤组织先分化根，后分化芽，并且获得了再生植株，因此关于萝卜花药愈伤组织的分化与芽的再生体系尚待进一步研究。

注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。

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