福氏志贺菌临床分离株CTX―M9及TEM基因的检测

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[摘要] 目的 探讨湖南永州地区福氏志贺菌临床分离株中β-内酰胺酶耐药基因ctx-m9及tem的检出情况。方法 采用分离培养以及生化和血清学鉴定临床分离株。K-B纸片扩散法分析其对抗菌药物的敏感性，同时针对CTX-M9及TEM基因设计特异性引物，采用PCR方法对齐进行扩增。结果 永州市区医院分离的55株福氏志贺菌，其中对氨卞西林的耐药率为87.3%，复方磺胺甲唑耐药率为83.6%，头孢曲松耐药率为15.3%。耐药基因TEM的2011年1月―2012年11月检出率为32.7%。CTX-M基因占所有阳性分离株的79.6%，其中同时携带TEM和CTX-M基因的占19.5%。结论 永州地区福氏志贺菌对氨卞西林、头孢曲松等抗生素耐药率较好，可能与CTX-M9及TEM 基因的高表达有关。

[关键词] 福氏志贺菌；β-内酰胺酶；CTX-M9；TEM

[中图分类号] R446 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2013）08（b）-0045-02

福氏志贺菌是引起腹泻病的常见致病体，由于临床上抗生素的广泛应用，福氏志贺菌的耐药率逐渐增多[1-2]。在众多的耐药基因当中，以TEM和CTX-M9以及OXA等β-内酰胺酶最常见[3]。为了探讨湖南永州地区福氏志贺菌的耐药性，本研究对本地区医院2011年1月―2012年11月分离到的55株福氏志贺菌耐药性进行了研究，并通过对CTX-M9以及TEM基因的检测，旨在观察耐药基因的流行情况。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

该研究所分离的55例临床分离株来自永州地区的腹泻患者的粪便标本，通过SS平板接种等方法筛出可疑菌落，并采用全自动细菌鉴定仪（法国梅里埃）鉴定细菌的种和群。

1.2 细菌药敏试验的测定

采用K-B纸片扩散法检测福氏志贺菌的耐药性，并按NCCLS2004年版标准判断结果。大肠埃希菌ATCC25922质控菌为ATCC产品。庆大霉素、氨苄西林、氨苄西林-舒巴坦、头孢曲松、环丙沙星、氯霉素和复方磺胺甲恶唑纸片购自美国BD 公司。

1.3 PCR 模板的制备

收集LB培养基中的菌体，用无菌PBS洗涤2次。经0.5 mL TE溶液混悬细菌后，加入裂解液（10% SDS 25 μL，20 g/μL蛋白酶K 7.5 μL）于42℃下裂解细菌。随后加入等体积饱和酚充分混匀，再用氯仿抽提，获取上清并加入 0.1 体积 3M NaAc，随后用2倍体积的乙醇-20℃沉淀DNA。待沉淀自然干燥后，TE 溶解并置于-20℃备用。

1.4 PCR扩增

采用套式PCR扩增TEM基因引物，外套引物：正向5’-ATAAAATTCTTGAAGACGAAA -3’，反向5’-GACAGTTACCCATGCTTAATCA -3’；内套引物正向5’-AGGAAGAGTATGAGT ATTCAACA -3’， 反向5’-CTCGTCGTTTGGTATGGC -3’。CTX-M引物：正向5’-ACAGCGATAACGTGGCGATG-3’，反向5’-TCACCCAATGCTTTACCCAGPCR-3’。产物基因通过与标准株比较序列后加以确定。

1.5 统计方法

采用SPSS13.0统计软件对结果进行学分析。计数资料采用χ2检验。为了方便统计， 将耐药为“中介”纳入“敏感”计算。

2 结果

2.1 OXA基因检测结果

氨苄西林、复方磺胺甲恶唑耐药率明显高于其他药物，分别为87.3%和83.6%，头孢曲松、氨苄西林-舒巴坦、左氧氟沙星耐药率较低分别为20%、34.5%、18.2%及5.5%。见表1。

2.2 福氏志贺菌产酶情况

纸片扩散法结果显示，55株福氏志贺菌中有21 株产ESBLs，占38.1%。

2.3 CTX-M和TEM基因分布情况

55株福氏志贺菌中18株检出TEM 基因， 阳性率32.7%；志贺菌对氨苄西林的耐药率高，其中TEM基因阳性志贺菌的耐药率为90.2%、TEM基因阴性志贺菌的耐药率为84.3%； 对氨苄西林-舒巴坦也有一定的耐药，TEM基因阳性志贺菌、TEM基因阴性志贺菌的耐药率分别为43.3%、23.6%。CTX-M基因占所有阳性分离株的79.6%，其中同时携带TEM和CTX-M基因的占19.5%。

3 讨论

在我国，福氏志贺菌依然是腹泻病的重要病原体。研究显示[4]，福氏志贺菌在我国耐药性有日趋增高趋势。其对β-内酰胺类药物的耐药性通常与携带的质粒、转座子或染色体上的抗性基因有关。质粒所携带的耐药基因不但能使该菌获得相应的耐药性，同时也能使敏感菌接受该质粒后获得耐药。志贺菌属的耐药基因，大部分为质粒编码，因而细菌之间可以通过接合作用而导致耐药质粒在细菌间转移[5-6]。TEM基因是β-内酰胺酶最常见的基因型之一。该研究结果表明，本地区福氏志贺菌对氨苄西林的耐药率高达87.3%，虽然低于与国内报道[7]的94.7%，但依然耐药形势严重。这表明氨苄西林已不适宜作为临床治疗志贺菌感染的一线用药。本研究同时也发现，福氏志贺菌对头孢曲松的耐药率为20%，与国内其他报道[8]相符（10.3%～30.8%）。同时，菌株对加氨苄西林-舒巴坦、阿莫西林/克拉维酸钾的耐药率分别达34.5%和43.6%，但对喹诺酮类药物敏感性较高，因此，临床在治疗志贺菌感染性腹泻时，应结合药敏试验结果。对于成人而言，喹诺酮可作为本地区的经验用药。本研究证实，TEM基因阳性志贺菌的耐药率为90.2%、TEM基因阴性志贺菌的耐药率为84.3%， 两组差异无统计学意义（P=0.75），这表明福氏志贺菌对β-内酰胺类抗生素的耐药可能还存在其他机制。除了TEM基因，CTX-M 型是传播最广泛的酶。根据其基因的同源性，可分为CTX-M1 群、CTX-M2 群、CTX-M8 群及CTX-M9 4个亚群。由于该基因自从1985年开始广泛传播，因此本文对其也进行了分析。结果显示永州地区显示CTX-M 基因的携带率占所有阳性分离株的79.6%。除此之外，有19.5%的耐药菌株能同时检测出TEM和CTX-M，这可能与第三代头孢菌素的滥用有关。因此及时监测福氏志贺菌耐药菌谱的变化，对防治细菌性痢疾以及指导临床用药具有重要意义。

[参考文献]

[1] 焦红星. 老年福氏志贺菌感染141例临床特点及耐药性分析[J]. 中国老年学杂志， 2011，31（14）：2740-2741.

[2] 高春燕， 刘树平， 高庆双， 等. 儿童福氏志贺菌中检出blaCTX-M-57型基因[J]. 中华微生物学和免疫学杂志， 2010（7）：607.

[3] 熊自忠， 李睿， 王鹏. 福氏志贺菌中质粒介导喹诺酮类耐药qnr基因的检测[J]. 中华传染病杂志， 2009（11）：641-643.

[4] 曲芬， 毛远丽， 鲍春梅， 等. 2000―2003年北京地区1542株腹泻病原菌药敏试验结果分析[J]. 中华检验医学杂志， 2005，28（4）：384-386.

[5] 靳会娟， 任艳平， 芦星， 等. 济源市91株福氏志贺菌的耐药性分析[J]. 现代预防医学， 2007，34（11）：2154-2155.

[6] 俞蕙， 王晓红， 叶颖子， 等. 儿童福氏志贺菌TEM型β内酰胺酶耐药基因及其耐药性检测[J]. 中国抗感染化疗杂志， 2005，5（5）：304-306.

[7] 王勇， 张凌， 苏文莉， 等. 北京部分地区肠道病原菌的分布及耐药状况[J]. 预防医学杂志， 2007，25（2）：94-97.

[8] 胡立芬， 李旭. 产β-内酰胺酶痢疾杆菌检测及其基因分析[J]. 安徽医科大学学报， 2007，42（1）：87-90.

（收稿日期：2013-06-25）