发酵纳豆中加入中药后对纳豆激酶活力的影响

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[摘要] 目的：通过对纳豆发酵中加入中药苦参、板蓝根、漏芦、红花后纳豆激酶活力的改变进行研究，从而筛选出能够提高纳豆激酶活力的中药，同时也将中药之药性融入其中，以便更好地提高纳豆之医疗、保健功能。方法：本实验采用纤维蛋白－琼脂糖平板法测定发酵后产物中纳豆激酶的活力大小。结果：苦参、板蓝根可提高纳豆激酶活性，漏芦可降低纳豆激酶活性，红花可抑制枯草芽孢杆菌的生长使之没有活性。结论：发酵纳豆中加入中药后对纳豆激酶的活力有不同程度的影响。

[关键词] 纳豆芽孢杆菌；纤维蛋白-琼脂糖平板法；纳豆激酶；中药

[中图分类号]R932 [文献标识码]A [文章编号]1673-7210（2008）03（c）-036-02

The experimental study of the influence of the fermented natto added into traditional Chinese medicine on the activity of nattokinase(NK)

JIAO Xiao-li，SUN Yan-ping*

（Heilongjiang Academy of Traditional Chinese Medicine，Harbin 150036, China）

[Abstract] Objective: To study the influence of the fermented natto added into traditional Chinese medicine-Radix sophorae flavescentis, Radix isatidis seu baphicacanthi, Radix rhapontici seu Radix echinopsis and Flos Carthami on the activity of nattokinase(NK), then the traditional Chinese medicine that can improve the activity of nattokinase(NK) is screened and its property is incorporated in nattokinase(NK),so the function of the medical treatment and health care of the natto are improved better. Methods: The activity of Nattokinase(NK) was detected through fibrin-agarose plate process in the experiment.Results: The results showed that the activity of Nattokinase(NK) could be improved by Radix sophorae flavescentis and Radix isatidis seu baphicacanthi but reduced by Radix rhapontici seu Radix echinopsis,while Flos carthami could restrain the growth of Bacilus subtilis and make it inactive. Conclusion: Traditional chinese medicine that is added into the fermented natto has different effects on the activity of Nattokinase(NK).

[Key words] Bacillus natto;Fibrin-agarose plate process;Nattokinase;Chinese traditional medicine

纳豆芽孢杆菌 (Bacillus natto)是从日本的传统发酵食品纳豆中发现并分离出来的，属细菌科芽孢杆菌属，其原始菌株与枯草芽孢杆菌相同，是枯草芽孢杆菌的一个亚种[1]。纳豆激酶 (Nattokinase，NK；也称 Subtilisin NAT，Subtilisin BSP)是由纳豆菌(Bacillus subtilis var. natto)产生的一种具有强烈溶栓功能的蛋白酶。该酶是由日本学者于1987年首次在日本传统食品纳豆中提取出来并命名的[2]。10余年来，研究者们对纳豆激酶的理化特性、作用机制及生产工艺等方面进行了较为详尽的研究。实验研究证实该酶不仅易于提取纯化，成本低廉，溶栓效果好，作用迅速，药效时间长，而且安全性好，无任何毒副作用[3，4]，较目前已开发研制的一些溶栓药物如尿激酶 (Urokinase，UK)、链激酶 (Streptokinase，SK)、组织型纤溶酶原激活剂 (tissue-type plasminogen activator，t-PA)等具有独特的优越性，有望成为一种新型溶栓药物。目前，国内尚未见纳豆芽孢杆菌发酵中加入中药后对提高纳豆激酶活性影响的报道。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1菌株枯草芽孢杆菌由本院提供；大豆购自北大荒粮油公司，为非转基因大豆（直径≤5 mm）。

1.1.2中药苦参、板蓝根、漏芦、红花均由本院中药房提供。

1.1.3试剂尿激酶1 000 U/支（哈高科白天鹅药业集团公司产品）、纤维蛋白原100 mg/支（Sigma，每毫克含75％可凝固蛋白）、琼脂糖（上海东海制药厂）、凝血酶（1 000 U/支）、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠。

1.2 方法

1.2.1原材料的处理将中药切片，去除杂质，清水浸泡使含水量在55％~60％。将大豆浸泡8 h，沥干水，备用。

1.2.2 液体菌种的制备将斜面种转接入灭菌后的PDA液体培养基内摇床培养(转速为140 转/min)24 h。

1.2.3 发酵基质的制备将浸泡好的中药分别称取50 g装入聚乙烯袋中，然后称取50 g浸泡过的大豆分别装入中药袋内，摇匀。另设对照组100 g大豆，高压121℃灭菌40 min，备用。

1.2.4发酵取菌龄为24 h的纳豆芽孢杆菌菌液1.5 ml 加入灭菌后的发酵基质中，放入38℃恒温培养箱内培养48 h后，观察各袋中大豆表面是否有黏丝出现，作为发酵终点。

1.2.5样品的制备取发酵后的样品各5 g，分别放入4个50 ml三角瓶中，加入0.9%生理盐水10 ml。取对照品发酵纳豆2.5 g，加入0.9%生理盐水10 ml，静止提取8 h，浸提后离心取上清液备用。另取4份中药各2.5 g加入0.9%生理盐水10 ml浸提液为对照品。即9个样品：(Ⅰ)发酵纳豆，(Ⅱ)漏芦＋大豆，(Ⅲ)苦参＋大豆，(Ⅳ)板蓝根＋大豆，(Ⅴ)红花＋大豆，(Ⅵ)漏芦浸提液，(Ⅶ)苦参浸提液，(Ⅷ)板蓝根浸提液，(Ⅸ)红花浸提液。

1.3 纤维蛋白-琼脂糖平板法

1.3.1试剂的配制

1.3.1.1 磷酸盐缓冲液（0.01 mmol/L, pH 7.75）取磷酸氢二钠3.58 g加水至1 000 ml；取磷酸二氢钠0.78 g，加水至500 ml。两液按1 000 ml∶190.5 ml混合（pH 7.75）。

1.3.1.2 工作液 取磷酸盐缓冲液（0.01 mmol/L）-0.9%氯化钠（1∶17）混匀，备用。

1.3.1.3 1％琼脂糖液取琼脂糖1 g，加工作液100 ml，加热溶解。

1.3.1.4 纤维蛋白原液取纤维蛋白原148 mg，加工作液配成0.3%的溶液。

1.3.1.5 凝血酶原溶液取凝血酶原1 000U，加生理盐水100 ml，配成浓度为10 U/ml的溶液。

1.3.2 平板的制备取琼脂糖融化后，吸取16.2 ml加入到50 ml三角瓶里，放50℃水浴中保温，同时将纤维蛋白原液16.2 ml、凝血酶原液1.3 ml亦在50℃水浴中加热和保温，待温度平衡后，将其混匀，迅速倒入9 cm×9 cm特制的玻璃平板中，室温放置30 min凝固即成。

1.3.3 标准品溶液取尿激酶1支（1 000 U/支），用0.9%氯化钠溶液配成每1 ml中含100、80、60、40、20 U 的5个浓度溶液。

1.3.4 测定方法用微量进样器分别吸取尿激酶标准品溶液及经处理的发酵后中药浸液10 μl，滴在打孔后的同一平板加盖，并在37℃温育18 h，取出后用游标卡尺测量溶圈垂直两径，以两直径乘积为纵坐标，尿激酶标准品单位数为横坐标，在双对数纸上绘制标准曲线。根据供试品溶圈垂直两直径乘积，在尿激酶标准曲线图上查得活力单位，计算样品效价单位数。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的制作

标准曲线的测定见表1。

表1 标准曲线的测定

标准活性（U）直径A（mm） 直径B（mm）乘积（mm2）

20 11.7612.0141.12

40 13.6013.63 185.424

60 15.8214.99 237.27

80 17.3216.60 287.51

100 18.2218.22 331.97

回归方程：Y＝2.418 9X+91.523 0，r=0.999 6

2.2 各组酶活力的测定

酶活力测定见表2。

表2在标准曲线下求出的各组酶活力

序号直径A（mm）直径B（mm）乘积（mm2）酶活力（U）

Ⅰ 13.6413.24 180.5936.82

Ⅱ 12.4212.02 149.2923.88

Ⅲ 15.6215.62 243.9859.30

Ⅳ 15.0114.92 223.9554.75

Ⅴ －－ － －

Ⅵ －－ － －

Ⅶ －－ － －

Ⅷ －－ － －

Ⅸ －－ － －

“－”：无溶圈

以上实验表明，纳豆发酵产物中添加苦参、板蓝根可提高纳豆激酶活性，漏芦可降低纳豆激酶活性，红花抑制枯草芽孢杆菌的生长使之没有活性，结果见表2。显示出中药的某些化学成分对微生物的生长有促进或抑止作用，或微生物将中药的非活性成分转化为纳豆激酶活性的激活物质，或者微生物分解了中药中可能促进微生物生长的生理调节因子，这三种原因都可能导致发酵产物对纳豆激酶活力的影响，另外，也不能排除纳豆激酶与中药成分有协同或拮抗溶栓的作用。具体为何种原因引起的改变，还有待进一步研究。

2.3 分析

以上结果是本发酵条件下对纳豆激酶活力的影响。但在以下条件下该结果有可能发生改变：①发酵基质中大豆与中药的比例改变，例如“芽孢杆菌发酵炮制红花增溶血栓药效研究”一文中，随红花含量的增加（0～5％）对地衣芽孢杆菌（bacillus lichniformis）起到从促进到抑制的作用。②发酵基质的含水量。③发酵时间的长短。④不同菌种发酵。这都将对发酵结果有影响，如能更全面地研究纳豆激酶活力受影响的原因，将对提高纳豆之医疗、保健功能起到重大意义。

[参考文献]

[1]布坎南,吉布斯.伯杰细菌学鉴定手册[M].第8版.北京：科学出版社，1984.735.

[2]Sumi H，Hamada H，Tsushima H，et al.A nove1 fibrinolytie enzyme(nattokinase)in the vegetable cheese natto：atypical and popular soybean food in the Japanese diet[J].Experientia，1987，43：1110-1111.

[3]Fuita M，Hong K，Ito Y,et al.Transport of nattokinase across the rat intestinal tract[J].Bio Pharm Bull，1995，18:1194-l196.

[4]胡景柱，夏寿华，吴林.纳豆冻干粉的安全性研究[J].安徽农业科学，2000，28(3):380-381.

（收稿日期：2007-12-24）

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