依达拉奉对大鼠脑缺血损伤后海马组织细胞凋亡的影响

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摘要：目的 探讨依达拉奉对脑缺血损伤后大鼠海马组织细胞凋亡的影响。方法 取健康Sprague-Dawley成年雄性大鼠60只，随机分为假手术对照组，缺血组和依达拉奉组3组，每组20只。对缺血组和依达拉奉组采用 Zea Longa等法改良复制大脑中动脉狭窄（middle cerebral artery occlusion， MCAO）动物模型，通过Tunel法检测神经元凋亡。结果 缺血组与依达拉奉组Tunel阳性细胞数明显增多。与缺血组比较，依达拉奉组Tunel阳性细胞数明显减少。结论 依达拉奉对脑缺血损伤后大鼠的神经保护作用可能是通过减少海马神经元凋亡进而改善脑缺血损伤后大鼠的脑损伤。

关键词：依达拉奉；海马神经元；脑缺血损伤

研究表明，脑缺血损伤可引起脑组织内神经化学物质的改变，这些神经化学物质的改变可以直接对神经元和胶质细胞产生神经毒性作用，由此可导致一系列损伤[1]。依达拉奉（edaravone）是一种新型自由基清除剂，具有清除自由基和抑制脂质过氧化的作用，其主要靶位是直接清除一氧化氮、羟自由基及抗氧化活性作用。在脑缺血模型中依达拉奉能减轻脑水肿，延缓神经元死亡，改善神经功能障碍[2]。本研究旨在探讨依达拉奉对脑缺血损伤的改善作用及机制。

1材料与方法

1.1 动物及分组 选用健康Sprague-Dawley成年雄性大鼠，购自河南省实验动物中心，体重250～280g，合格证号：SCXK（豫）2010-0002。清洁动物房饲养，恒温恒湿[温度（24±2）℃，湿度60%左右]，SPF级大鼠饲料喂养，自由进水（消毒蒸馏水），整个实验期间自由饮水、饮食。60只大鼠随机分为假手术组、缺血组，依达拉奉治疗组（简称治疗组），每组20只。

1.2 方法

1.2.1 各组动物模型制备 缺血组动物模型制备：采用Zea Longa[3]等法改良制备MCAO大鼠模型：大鼠适应饲养1w，术前禁食12h，禁水4h，10%水合氯醛腹腔注射（0.3～0.4ml/100g）麻醉，仰卧位固定，备皮，颈部正中切口，逐层分离皮肤及皮下组织，暴露右颈总动脉、颈内动脉及颈外动脉，双凝电极电灼离断颈外动脉各分支，手术线结扎颈外动脉颈总动脉主干近心端阻断其血流，经颈总动脉近分叉处切口插入线栓，将线栓顺颈内动脉走向轻柔缓慢推进约18mm时（可感到阻力增大），此时线栓已经通过大脑中动脉起始段进入了较细的大脑前动脉，大脑中动脉主干血流已经被阻断，系紧预先准备好的手术线，固定线栓于颈总动脉上防止滑脱与出血，检查无活动性出血后，将钓鱼线末段固定在皮下。逐层关闭各层组织，0.5 g/只青霉素粉局部抗菌，缝合皮肤。术中保持室温25℃左右，用100W 的白炽灯照射大鼠以维持肛温在（37±1）℃，直到大鼠恢复活动。术后在约20℃的空调环境下分笼饲养，自由进食、进水。假手术组动物模型制备：此组20只大鼠不进行右颈总动脉、颈内动脉及颈外动脉的相关操作，其余操作同缺血组。治疗组动物模型制备：此组动物模型操作同缺血组。

1.2.2 神经功能评分 对缺血组和治疗组大鼠麻醉清醒后立即根据Longa[4]法（5级4分法）行神经功能缺损评分，判断模型是否成功。0 分（ 0 级） ：无神经功能缺损症状：如提鼠尾观察前肢屈曲，双前肢对称伸向地面；1分（ Ⅰ级）：轻度局灶性神经功能缺损，即提尾悬空不能伸展，对侧前肢出现腕屈；2 分（ Ⅱ级） ：中度局灶性神经功能缺损，即行走向左侧转圈，手术的对侧前肢出现肘屈曲；3 分（ Ⅲ级） ：重度局灶性神经功能缺损，即行走困难，并向左侧倾倒；4 分（ Ⅳ级） ：不能自发行走，无意识或昏迷。分数越高，动物行为障碍越严重。Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级为模型成功，符合入选标准者进行下步实验。根据评分随时补充模型大鼠的数量，保证缺血组和治疗组每组20只大鼠。

1.2.4 用药 缺血组大鼠和假手术组大鼠腹腔注射0.9 %氯化钠溶液（1ml/ kg·d），治疗组大鼠注射依达拉奉（3mg/ kg·d），用药时间均为为2w [5]。

1.2.5形态学实验 待上述实验内容完成后，处死动物，断头开颅，分离海马，石蜡包埋，4um连续切片。一部分切片在40 × 10 倍光镜下计数每张切片5 个随机视野细胞数，取其平均值作为计数结果。另一部分标本行Tunel法]检测，参考试剂盒说明书进行具体操作步骤，二氨基联苯胺（DAB）显色，中性树脂封片。光镜下每组各选阳性细胞最集中的5个高倍视野，计算出每个高倍视野的阳性细胞数，取其平均值[6]。保留记录各组实验结果，备统计学分析对比。

1.2.6统计学方法 首先进行数据的正态性检验和方差齐性检验，应用SPSS13. 0 软件包进行统计学处理，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法，p

2 结果

2.1 Tunel法检测神经元凋亡

TUNEL染色阳性物质定位于细胞核，强阳性染色被认为是凋亡。TUNEL阳性细胞主要在神经元及神经胶质细胞，细胞核固缩有的呈碎片状， 不规则， 大小不一致，呈棕黄色颗粒者为阳性细胞，形成典型的“指环状”或“半月状”的细胞凋亡特征。

与假手术组相比， 缺血组大鼠海马CA1区神经元凋亡数目明显升高（ P < 0. 01）；与缺血组比较，依达拉奉治疗组大鼠海马CA3区神经元凋亡数目明显降低（P < 0. 05） ，见表1。

3 讨论

脑血管疾病是目前严重威胁人类健康的疾病之一，成为影响人类生存质量的最大障碍。及早应用神经保护剂可延长脑细胞缺血耐受时间，减小梗死体积，可以使病、伤、残者能尽快、尽可能恢复功能。因此，探讨脑缺血损伤后的发病机制及其药物保护问题就显得十分必要。

脑缺血引起的神经元损伤包含凋亡与坏死两种方式[7]，海马神经元的凋亡是脑缺血损伤后神经元死亡的重要方式[8]。依达拉奉是一种新型自由基清除剂，其分子量小，具有亲脂基团，血脑屏障的通透性高达60%，可清除脑中具有高度细胞毒性的羟基基团，抑制黄嘌呤氧化酶和次黄嘌呤氧化酶的活性，刺激前列环素的生成，减少炎性介质白三烯的产生，降低羟自由基浓度[9]。本研究发现，依达拉奉形态学观察显示，依达拉奉治疗组结扎侧正常神经细胞数量较多，排列较密，胞核呈圆形或椭圆形，核仁清晰，染色质丰富，少见固缩变性的神经细胞。实验表明依达拉奉降低海马神经元对凋亡刺激的敏感性，减少海马神经元的凋亡，达到抗凋亡作用。

参考文献

[1] Wu TW，Zeng LH，Wu J，et a1。MCT一186：further histochemical and biochemical evidence of neuroprotection[J].Life Sciences，2000，67：2387-2392.

[2]杨政，治疗急性脑梗死的新型脑保护药依达拉奉[J].中国新药杂志，2002，11（12）：911-913.

[3] Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al. Reversible middlecerebral-artery occlusion without craniectomy in rats[J]. Stroke，1989，20（1） ：84 - 91.

[4]沈斌，Xu HL.线栓法制备SD大鼠局灶性脑缺血/再灌注模型的改良研究[J].首都医科大学学报，2007，28（6）：782-784.

[5]刘学春，依达拉奉改善急性一氧化碳中毒性脑病大鼠空间记忆及海马神经元凋亡的研究[J].中国工业医学杂志，2011，24（3）：175-178.

[6] 夏朝霞，原位细胞凋亡技术TUNEL法的改进[J].现代实用医学，2010，22（6）：642-643

[7] Datta SR，Brunet A，Greenberg ME，et al.cellular survival：a play in three Akts[J].（Genes Development，1999，13：2905.

[8] 朱欢，新生鼠脑缺氧缺血性损伤后海马区细胞增殖的观察[J].东南大学学报（医学版），2007，26（3）：177-180.

[9]邱宗琴，冯涛，张玉丰，等.依达拉奉对大鼠脑缺血一再灌注损伤的神经保护作用[J].北华大学学报（自然科学版），2007，8（5）：402—404.