E3泛素连接酶HECTD3真核表达质粒的构建

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【摘要】 目的 克隆e3泛素连接酶 （homologous to the E6-associated protein carboxyl terminus domain containing 3， hectd3） 基因及构建真核表达质粒。方法 提取人卵巢癌细胞SKOV-3细胞RNA， 并逆转录为cDNA， 以此作为模板PCR法扩增HECTD3基因， 将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1（+）， 测序验证构建质粒中包含HECTD3基因。结论 HECTD3基因克隆及真核表达质粒构建成功， 可以用于后续卵巢癌发生发展的分子生物学研究。

【关键词】 E3泛素连接酶；卵巢癌；真核表达质粒

泛素化是一种蛋白质的翻译后修饰， 参与调控多种生物学过程， 其系统功能的紊乱与癌症发展进程密切相关[1]。HECTD3 （homologous to the E6-associated protein carboxyl terminus domain containing 3）是一个功能目前尚未阐述清楚的新的E3泛素连接酶。有报道指出该基因可能在乳腺癌和宫颈癌中介导顺铂的化疗耐受[2]， 但是目前尚未有人报道HECTD3在卵巢癌中的作用。且卵巢癌是致死率最高的妇科恶性肿瘤， 仅2011年1年就导致全世界140000人死亡[3]。因此本文拟克隆HECTD3基因， 并构建该基因真核表达质粒， 对进一步研究HECTD3基因在卵巢癌发生发展中的作用提供有力的工具和手段。

1 实验材料

卵巢癌细胞SKOV-3、真核表达载体pCDNA3.1、大肠杆菌DH5α感受态由本室保存。RPMI-1640、胎牛血清、胰酶购自美国Gibco公司。PrimeSTARHS DNA Polimerase with GC Buffer、EcoR I和Nhe I限制性外切酶购自TaKaRa公司。Gel Extraction Kit购自omega公司， DL2000、1Kb DNA Marker购自天根生化科技有限公司。引物由invitrogen公司合成， 测序也由该公司完成。其余试剂购自广州威佳生物有限公司。

2 试验方法

2. 1 HECTD3基因的扩增 采用Trizol法提取SKOV-3细胞RNA， 并逆转录成cDNA。以该cDNA为模板进行HECTD3基因的扩增， Forward Primer： 5’-GGCgctagcATGGCGGGTCC-TGGCCCGG-3’， Reverse Primer：5’-GGCgaattcTCACTCCTCCCAAGGGCTCATGTCA-3’， 其中小写黑体的序列表示酶切位点。 PCR结果用1%琼脂糖凝胶检测。将扩增的目的条带用胶回收试剂盒回收， 具体操作见说明书。

2. 2 pcDNA-HECTD3重组质粒的构建 利用限制性内切酶NheI和EcoRI， 37℃ 2 h消化真核表达载体pcDNA3.1（+）和PCR扩增得到的HECTD3基因片段， 回收载体和基因片段的酶切产物。T4 DNA Ligase 于16℃连接载体和基因片段。连接过夜后， 将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞， 挑取单克隆送invitrogen公司测序。

3 结果

成功构建HECTD3真核表达质粒

从NCBI上得到HECTD3基因序列（gene bank number： NM_024602.5）， 该基因开放阅读框（open reading frame， ORF）全长是2586 bp， 编码861 aa。由图1.A可以看出PCR反应组在2500 bp左右有一条目标条带， 割胶回收该条带， 将回收后的PCR条带和pcDNA3.1（+） 载体用限制性酶消化， 图1.B即为消化后的pcDNA3.1（+） 载体， 该载体分子量大小为5428 bp。线性化的pcDNA3.1（+） 分子量大小与预期相符， 证明酶切反应成功。将酶切之后的载体和目的基因片段回收纯化， 连接， 并转化感受态细胞DH5α， 挑取单克隆5个， 送至invitrogen公司测序鉴定阳性克隆。阳性克隆序列在NCBI上比对序列（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）， 将成功构建的HECTD3基因真核表达质粒命名为pcDNA-HECTD3。

（A）HECTD3基因的扩增：泳道1是PCR扩增反应组；泳道2是阴性对照组， 以双蒸水代替cDNA模板；泳道3是天根DL2000 Marker；泳道4是天根1 Kb DNA Marker。（B）NheI和EcoRI 限制性外切酶37℃消化载体pcDNA3.1（+） 2h， 1%琼脂糖 凝胶检测酶切效果：泳道1是天根1 Kb DNA Marker， 泳道2是线性化的pcDNA3.1（+）载体。

4 讨论

HECTD3基因是Yu J等人通过酵母双杂交技术发现的一个新的E3泛素连接酶。他们发现HECTD3能够在体内外与Tara形成复合物， 通过调节泛素化和降解Tara来参与细胞进程[4]。HECTD3基因C端有一个高度保守的HECT domain， N端有一个功能部分受损的DOC domain， 该domain主要是用于底物特异性识别的[5， 6]。也有学者通过免疫共沉淀技术发现HECTD3能够与Syntaxin 8形成复合物， 过表达HECTD3将会促进Syntaxin 8的泛素化， 说明HECTD3可能参与了神经元的发育[7]。由于HECTD3基因ORF涉及较多的高GC含量序列， 扩增该基因存在一定的难度。本研究采用高GC PCR buffer顺利得到HECTD3基因片段并成功构建该基因的真核表达质粒。在后续的研究中， 我们将在mRNA水平和蛋白水平检测该基因的表达情况， 同时构建该基因稳定表达的SKOV-3细胞系， 以期深入探讨体外过表达该基因所引起的一些列细胞学变化及其具体的分子机制。

参考文献

[1] Chen C， Seth A K， Aplin A E. Genetic and expression aberrations of e3 ubiquitin ligases in human breast cancer. Mol Cancer Res， 2006， 4（10）： 695-707.

[2] Li Y，Chen X，Wang Z，et al.The HECTD3 E3 ubiquitin ligase suppresses cisplatin-induced apoptosis via stabilizing MALT1. Neoplasia， 2013， 15（1）： 39-48.

[3] Jemal A，Bray F，Center M M，et al.Global cancer statistics.CA Cancer J Clin， 2011， 61（2）： 69-90.

[4] Yu J，Lan J，Zhu Y，et al. The E3 ubiquitin ligase HECTD3 regulates ubiquitination and degradation of Tara. Biochem Biophys Res Commun， 2008，367 （4）： 805-812.

[5] Pál M，Varga K，Nagy O，et al.Characterization of the Apc10/Doc1 subunit of the anaphase promoting complex in Drosophila melanogaster. Acta Biol Hung， 2007， 58： 51-64.

[6] Kaustov L，Lukin J，Lemak A，et al.The conserved CPH domains of Cul7 and PARC are protein-protein interaction modules that bind the tetramerization domain of p53. J Biol Chem， 2007， 282（15）： 11300-11307.

[7] Zhang L，Kang L，Bond W，et al.Interaction between syntaxin 8 and HECTd3， a HECT domain ligase.Cell Mol Neurobiol， 2009， 29 （1）： 115-121.